人腦膠質(zhì)瘤MGMT表達及miR-4539對MGMT表達調(diào)控作用的研究.pdf

1、腦膠質(zhì)細胞瘤是由于大腦中的膠質(zhì)細胞癌變所引起的，在原發(fā)性的顱內(nèi)腫瘤中最為常見，約占顱內(nèi)所有惡性腫瘤的50％，發(fā)病率為3～10/10萬，占全身惡性腫瘤的1％～3％，病人死亡率較高。目前膠質(zhì)瘤主要通過手術(shù)切除，隨后放射治療和替莫唑胺(TMZ)化療聯(lián)合治療。TMZ是新一代的烷化劑類抗腫瘤藥物，能夠穿過血腦屏障并通過產(chǎn)生引發(fā)DNA錯配修復(fù)途徑的無效循環(huán)的甲基加合物而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。目前臨床使用TMZ治療膠質(zhì)瘤的效果并不能達到令人滿意的程度，主

2、要的原因是部分膠質(zhì)瘤患者對烷化劑化療藥物存在耐藥性。近來有研究表明，導(dǎo)致烷化劑類藥物耐藥主要的原因是DNA修復(fù)酶O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)的存在。MGMT通過將烷基從DNA鳥嘌呤的O6位置轉(zhuǎn)移到其半胱氨酸殘基來逆轉(zhuǎn)DNA烷基化過程，恢復(fù)腫瘤細胞的繁殖增生能力，膠質(zhì)瘤具有升高的MGMT活性時通常顯示對TMZ治療的化學(xué)抗性。一些研究已經(jīng)證實，當M

3、GMT啟動子處于甲基化狀態(tài)時，能夠使MGMT基因處于靜止狀態(tài)，進而阻止其所介導(dǎo)的DNA修復(fù)功能和從而增強膠質(zhì)瘤對烷化劑的敏感性。MicroRNA(miRNA)通過與靶基因的非編碼區(qū)結(jié)合而導(dǎo)致靶mRNA的降解或翻譯過程的抑制，進而調(diào)控基因的表達，參與一系列生物學(xué)行為。
　　研究目的:檢測MGMT在膠質(zhì)瘤病例標本中的表達水平，分析MGMT表達水平與膠質(zhì)瘤級別、膠質(zhì)瘤大小之間的關(guān)系，探尋能夠影響MGMT表達水平的MiRNA，并為緩解部分

4、膠質(zhì)瘤患者對烷化劑類藥物耐藥尋找新的作用靶點。
　　研究方法:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院隨機選擇47例于2015年7月至2015年11月接受手術(shù)切除的患者神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織樣本。所有樣品通過獨立的病理學(xué)檢查鑒定為神經(jīng)膠質(zhì)瘤。每例樣本分為兩部分，一部分用于組織切片進行免疫組織化學(xué)染色檢測MGMT表達量，另一部分用于提取RNA。根據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標準（2007年），將取得的膠質(zhì)細胞瘤標本分為Ⅰ-Ⅳ級，其中低惡性組包含Ⅰ級與Ⅱ級，高惡性組

5、包含Ⅲ級與Ⅳ級。選用患者顱腦磁共振橫斷位液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)(fluidattenuated inversion recovery，F(xiàn)LAIR)序列成像測量最大直徑。免疫組化中采用H評分法對MGMT表達情況進行定量。使用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，MGMT表達陽性率與膠質(zhì)瘤級別及大小的關(guān)系采用x2檢驗。miRNA及mRNA表達水平計算采用2^-△△CT方法計算，實驗組與對照組兩組間的比較采用t-檢驗法，p＜0.05為具有顯

6、著統(tǒng)計學(xué)差異。利用miRNA數(shù)據(jù)庫(TargetScan database; http://www.targetscan.org/vert_61/)找出在MGMT3'UTR存在結(jié)合位點的miRNA，并進行細胞水平驗證。對膠質(zhì)瘤組織中MGMT與miRNA的表達量采用Westen blot及Real-Time PCR方法檢測，明確兩者表達關(guān)系。構(gòu)建MGMT3'UTR熒光素酶野生型及突變型載體，進行雙熒光素酶檢測，明確兩者調(diào)控關(guān)系。細胞水平驗

7、證，選取MGMT表達相對較高的膠質(zhì)瘤細胞系轉(zhuǎn)入miRNA mimics及inhibitor，檢測MGMT表達變化情況。功能驗證，對轉(zhuǎn)入miRNAmimics及inhibitor的細胞進行耐藥性實驗，利用cck-8，凋亡蛋白表達情況及流式細胞術(shù)檢測細胞增殖及凋亡情況。探討miRNA-4539對MGMT的調(diào)控作用，及這種作用在膠質(zhì)瘤中的表達與替莫唑胺(TMZ)耐藥之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:1.MGMT在膠質(zhì)瘤組織中的表達量與膠質(zhì)瘤病理級

8、別及膠質(zhì)瘤大小沒有相關(guān)關(guān)系;2.MGMT與MiRNA-4539在膠質(zhì)瘤組織中表達呈負相關(guān)關(guān)系;3.MiRNA-4539能夠作用于MGMT3'UTR，抑制其表達;4.在體外細胞水平，轉(zhuǎn)入MiRNA-4539 mimics時MGMT表達下降，轉(zhuǎn)入MiRNA-4539 inhibitor時MGMT表達升高;5.在體外細胞水平，轉(zhuǎn)入MiRNA-4539 mimics時，膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的耐藥性減低，而轉(zhuǎn)入MiRNA-4539 inhibito