DNA修復(fù)基因MGMT沉默對人腦膠質(zhì)瘤化療的影響.pdf

1、膠質(zhì)瘤細胞對烷化劑類化療藥物產(chǎn)生抗藥性是化療失敗的一個主要原因。DNA修復(fù)酶—O6—甲基鳥嘌呤—DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6—methylguanine DNA methyltransferase，MGMT）在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達與腫瘤細胞對雙氯乙亞硝脲（Carmustine，BCNU）等亞硝脲類藥物的耐藥密切相關(guān)，并影響腫瘤的化療效果和病人的預(yù)后。探討通過特異性封閉MGMT基因，抑制MGMT mRNA的表達，達到逆轉(zhuǎn)MGMT的目的，是MGM

2、T研究的熱點。目前MGMT基因治療的策略主要有：使用MGMT酶活性抑制劑、核酶技術(shù)、反義RNA技術(shù)。RNAi（RNA interference）技術(shù)是誘導(dǎo)基因沉默的一種新技術(shù)。RNAi自誕生以來，不僅應(yīng)用于基因功能分析，而且作為基因治療的一種方法，在腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域中獲得了較大進展。 本課題從三個方面對MGMT進行了系統(tǒng)研究：①MGMT在膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤細胞系/株中的表達及其與MGMT基因啟動子區(qū)甲基化之間的關(guān)系；②構(gòu)建3條針對

3、MGMT的siRNA質(zhì)粒載體；③采用脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染T98細胞系，觀察轉(zhuǎn)染后腫瘤細胞中MGMT的表達情況及其對BCNU敏感性的變化。 第一部分 MGMT在膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤細胞系/株中的表達及意義 目的：研究MGMT在膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤細胞系/株中的表達及其與MGMT基因啟動子區(qū)甲基化之間的關(guān)系。 方法：研究對象為13株人腦膠質(zhì)瘤細胞系/株、35例臨床膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織。采用美國Gentra公司的試劑盒以鹽析法提

4、取基因組DNA，并采用美國Chemicon公司CpGenomeTM DNA修飾試劑盒對組織DNA進行亞硫酸氫鹽修飾，采用甲基化特異性PCR法（Methylation—specific PCR，MSP）進行MGMT基因啟動子區(qū)甲基化水平的檢測；采用sulforhodamine B（SRB）Colorimetric抗癌藥篩選法測定人腦膠質(zhì)瘤細胞系/株對BCNU的敏感性；采用免疫組化的方法來檢測膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織標本中MGMT蛋白的表達程度。

5、 結(jié)果：13株膠質(zhì)瘤細胞系/株中有8株存在MGMT基因啟動子區(qū)甲基化，其中有7株對BCNU敏感，1株耐藥；其余5株為MGMT基因啟動子區(qū)去甲基化，均對BCNU耐藥。用Spearman相關(guān)系數(shù)分析：P<0.05；按性別分組，男性患者的腫瘤組織MGMT蛋白表達陽性率為59.1%（13/22），女性患者的腫瘤組織MGMT蛋白表達陽性率為69.2%（9/13），男女兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05；按年齡分組，≤53歲年齡組、>53

6、歲年齡組患者組織的MGMT蛋白表達陽性率分別為66.7%（12/18）、58.8%（10/17）。兩組間MGMT蛋白表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05；按病理分級分組，病理分級Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級患者組織的MGMT蛋白表達陽性率分別為100.0%（2/2）、53.8%（7/13）、61.1%（11/18）、100%（2/2），采用非參數(shù)多個獨立樣本秩和檢驗來進行統(tǒng)計分析，各組間MGMT蛋白表達陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05；在

7、35例膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織標本中，22例MGMT蛋白表達呈陽性的膠質(zhì)瘤組織中7例組織MGMT基因啟動子區(qū)甲基化，陽性率為31.8%；13例MGMT蛋白表達呈陰性的膠質(zhì)瘤組織中11例組織MGMT基因啟動子區(qū)甲基化，陽性率為84.6%。用Spearman相關(guān)系數(shù)分析：P<0.05。 結(jié)論：在人腦膠質(zhì)瘤細胞系/株中，MGMT基因啟動子區(qū)過甲基化與其對BCNU的敏感性相關(guān)。膠質(zhì)瘤細胞MGMT基因啟動子區(qū)過甲基化，膠質(zhì)瘤細胞系/株對BCN

8、U敏感；膠質(zhì)瘤細胞MGMT基因啟動子區(qū)去甲基化，膠質(zhì)瘤細胞系/株對BCNU耐藥。MGMT蛋白的表達與MGMT基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)相關(guān)，與膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別及病理分級無相關(guān)性。MGMT基因啟動子區(qū)過甲基化，MGMT蛋白表達較低；MGMT基因啟動子區(qū)去甲基化，MGMT蛋白表達較高。 第二部分 MGMT基因RNAi質(zhì)粒載體的構(gòu)建及鑒定 目的：構(gòu)建MGMT基因的siRNA（small interfering RNA）質(zhì)粒

9、載體pRNAT—H1.1/Neo—MGMT siRNA，為進一步研究siRNA對MGMT基因的抑制作用，探討MGMT在膠質(zhì)瘤的化療耐藥及逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細胞耐藥表型中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法：針對MGMT的靶序列設(shè)計合成三條shRNA（small hair RNA）的DNA模板單鏈，同時模板鏈兩端分別設(shè)計BamHⅠ和HindⅢ限制酶切位點。退火形成siRNA載體插入片斷。用限制性內(nèi)切酶將pRNAT—H1.1/Neo線性化，T4連接酶將插

10、入片斷插入pRNAT—H1.1/Neo中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后培養(yǎng)出陽性克隆，抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切、電泳和測序的方法鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。 結(jié)果：設(shè)計構(gòu)建三條針對MGMT基因的siRNA質(zhì)粒載體，經(jīng)雙酶切，在2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：PCR產(chǎn)物大小76bp，產(chǎn)物大小與設(shè)計的完全相同。測序結(jié)果證明序列正確。 結(jié)論：成功設(shè)計構(gòu)建了三條針對MGMT基因的siRNA質(zhì)粒載體，為研究RNA干擾逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細胞的耐藥表型提供了

11、良好的實驗材料。 第三部分 siRNA干擾MGMT基因表達的初步研究 目的：探討三條針對MGMT基因的siRNA質(zhì)粒載體逆轉(zhuǎn)T98細胞MGMT mRNA、MGMT蛋白表達及對BCNU敏感性的效果。 方法：通過LipofectimineTM2000將三條MGMT的siRNA質(zhì)粒載體及空載體分別轉(zhuǎn)入T98細胞中，以綠色熒光蛋白（GFP）基因為報告基因，用流式細胞儀和熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率和G418篩選4周后質(zhì)粒表達效

12、率。采用實時定量PCR（Real—time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RQ—PCR）法測定MGMT mRNA的表達，Western Blot測定MGMT蛋白的表達。MTT法測定siRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染前后T98細胞系對烷化劑BCNU的敏感性變化。 結(jié)果：在熒光顯微鏡下觀察：經(jīng)LipofectimineTM2000轉(zhuǎn)染的T98細胞在轉(zhuǎn)染后48h，在顯微鏡下可見細胞呈現(xiàn)明顯的綠色熒光

13、，說明轉(zhuǎn)染成功。用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率分別為15.9%（siRNAl）、15.5%（siRNA2）、16.7%（siRNA3）、11.1%（陰性對照），4周后再次檢測質(zhì)粒表達率分別為81.1%（siRNA1）、79.6%（siRNA2）、88.1%（siRNA3）、86.1%（陰性對照）；由實時定量RT—PCR可知：三種MGMT siRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染T98細胞后，其MGMT mRNA的表達受到抑制。相對陰性對照而言，siRNA2抑制

14、作用最為明顯，達到87%，siRNA1次之，為74%，siRNA3為65%；采用Western blot法對MGMT蛋白表達測定的結(jié)果顯示：干擾組（T98/MGMT siRNA1； T98/MGMT siRNA2； T98/MGMT siRNA3）MGMT蛋白表達量較空白對照組及陰性對照組明顯減少，MGMT蛋白的表達在干擾組間無顯著差異；采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后T98細胞對BCNU的敏感性：轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒載體后，BCNU對T98細胞作

15、用的劑量一反應(yīng)曲線，相對于未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載體T98細胞的曲線左移。未轉(zhuǎn)染的T98細胞對BCNU耐藥，其IC50為140.56μg/ml，而轉(zhuǎn)染后的細胞其IC50分別為126.18μg/ml（陰性對照）、44.50μg/ml（siRNA1）、23.12μg/ml（s1RNA2）、56.87μg/ml（siRNA3）。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒載體的T98細胞對BCNU的敏感性增加。 結(jié)論：LipofectimineTM2000在轉(zhuǎn)