shRNA沉默c-Myc基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及VEGF表達(dá)的影響研究.pdf

1、目的: 本研究采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建c-Myc癌基因靶向的shRNA質(zhì)粒，沉默人類多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株IN500△細(xì)胞中c-Myc基因的表達(dá)，探討c-Myc癌基因在體外和體內(nèi)對(duì)膠質(zhì)瘤IN500△細(xì)胞增殖及凋亡的影響。同時(shí)檢測(cè)c-Myc基因沉默對(duì)膠質(zhì)瘤IN500△細(xì)胞中VEGF表達(dá)的影響，探討c-Myc基因在膠質(zhì)瘤中的地位及其對(duì)血管新生的調(diào)控作用，為膠質(zhì)瘤基因治療和抗血管新生治療提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 方法： 1

2、.shRNA質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：構(gòu)建以c-Myc基因?yàn)榘邢虻膕hRNA干擾質(zhì)粒pCMYC，同時(shí)構(gòu)建pHK質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的方法，將pCMYC及pHK質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入IN500△細(xì)胞中，并經(jīng)G418篩選，以質(zhì)粒中綠色熒光蛋白為標(biāo)記建立穩(wěn)定表達(dá)相應(yīng)質(zhì)粒的IN500△-pCMYC及IN500△-pHK細(xì)胞株。 2.shRNA質(zhì)粒對(duì)靶向基因沉默效應(yīng)的檢測(cè)：以未轉(zhuǎn)染IN500△細(xì)胞作為空白對(duì)照，采用RT-PCR方法檢測(cè)各

3、組細(xì)胞細(xì)胞中c-Myc及VEGF mRNA水平的表達(dá)變化；采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)各組細(xì)胞中c-Myc及VEGF蛋白水平的表達(dá)變化。 3.pCMYC質(zhì)粒對(duì)IN500△細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響： 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IN500A、IN500△-pHK及IN500△-pCMYC三組細(xì)胞的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡變化情況。 4 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pCMYC質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響：將IN500△、IN500△-pHK及IN500△-pC

4、MYC各組細(xì)胞分別接種至裸鼠皮下成瘤，觀察成瘤率及腫瘤生長(zhǎng)情況，繪制腫瘤體積生長(zhǎng)曲線及重量條形圖。 5 pCMYC質(zhì)粒對(duì)體內(nèi)IN500△細(xì)胞c-Myc及VEGF蛋白表達(dá)的影響：采用免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)三組移植瘤中c-Myc及VEGF蛋白的表達(dá)情況。 6 pCMYC質(zhì)粒對(duì)體內(nèi)IN500A細(xì)胞凋亡的影響：采用TUNEL原位細(xì)胞凋亡法檢測(cè)三組移植瘤中細(xì)胞凋亡情況。 7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

5、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD和SNK-T檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)和Spearman等級(jí)相關(guān)，以0.4＜r＜0.7為中度相關(guān)，r≥0.7為高度相關(guān)。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建以c-Myc基因?yàn)榘邢虻膒CMYC-shRNA質(zhì)粒，并建立了穩(wěn)定表達(dá)該質(zhì)粒的細(xì)胞株。 2.pCMYC-shRNA質(zhì)粒對(duì)IN500A

6、細(xì)胞中c-Myc及VEGF基因mRNA水平表達(dá)的影響：RT-PCR后電泳結(jié)果顯示，IN500△、IN500△-pHK及IN500△-pCMYC細(xì)胞中c-MycmRNA電泳條帶的平均光密度值與GADPH各相應(yīng)平均光密度值的比值分別為1.185±0.145、1.098±0.128及0.273±0.028：相應(yīng)VEGF各平均光密度值與GADPH各相應(yīng)平均光密度值的比值分別為1.116±0.072、1.208±0.133及0.443±0.048

7、。單因素方差分析(One-way ANOVA)及LSD、SNK-T兩兩比較結(jié)果示IN500△-pCMYC細(xì)胞組IN500△細(xì)胞中c-Myc與VEGFmRNA表達(dá)降低，與IN500△細(xì)胞組及IN500△-pHK細(xì)胞組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；IN500△細(xì)胞組與IN500A-pHK細(xì)胞組IN500A細(xì)胞中c-Myc與VEGF mRNA表達(dá)水平均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；Pearson相關(guān)分析示c-Myc與VEGF mRN

8、A表達(dá)之間存在正相關(guān)(r=0.938)，為高度相關(guān)(P＜0.01)。 3 pCMYC-shRNA質(zhì)粒對(duì)IN500△細(xì)胞中c-Myc及VEGF蛋白水平表達(dá)的影響：免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，IN500△細(xì)胞及IN500△-pHK細(xì)胞中c-Myc與VEGF蛋白表達(dá)水平均高，IN500△細(xì)胞中二者的平均陽(yáng)性率分別為90.02％±3.36％和84.39％±5.84％，IN500△-pHK細(xì)胞中二者的平均陽(yáng)性率分別為86.79％±2.22％和23.

9、52％±3.44％，Kmskal-Wallis H檢驗(yàn)及Mann-Whiney U檢驗(yàn)示兩組c-Myc與VEGF表達(dá)之間相比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；IN500△-pCMYC細(xì)胞中c-Myc與VEGF蛋白表達(dá)水平均顯著降低，細(xì)胞平均陽(yáng)性率分別為24.52％±4.39％和23.52％±3.44％，與IN500A及IN500△-pHK細(xì)胞組相比有顯著性差異(P＜0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析示在三組細(xì)胞中c-Myc與VEGF

10、表達(dá)之間均存在正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.886、0.829和0.771，各相關(guān)系數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 4 pCMYC-shRNA質(zhì)粒對(duì)IN500△細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果示，IN500△細(xì)胞處于G1期的細(xì)胞占36.9±4.7％，處于S期的細(xì)胞數(shù)占43.2±6.1％： IN500△-pHK細(xì)胞組中G1期細(xì)胞占34.4±5.3％，S期細(xì)胞占50.1±7.6％；IN500△-pCMYC細(xì)胞中處于

11、G1期細(xì)胞占72.9±7.5％，S期細(xì)胞占9.8±3.3％。Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)及Mann-Whiney U檢驗(yàn)示IN500△組與IN500△-pHK組間細(xì)胞周期分布無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，IN500△組及IN500△-pHK兩組與IN500△-pCMYC組間比較，細(xì)胞周期分布均存在顯著性差異（P＜0.01)。 5 pCMYC-shRNA質(zhì)粒對(duì)IN500△細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果示，IN500△組

12、、IN500△-pHK組及IN500△-pCMYC組細(xì)胞凋亡率分別為7.13％±3.57％、10.40％±4.88％及46.51％±4.99％。Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)及Mann-Whiney U檢驗(yàn)示IN500△組與IN500△-pHK組間細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；IN500A組及IN500△-pHK兩組與IN500△-pCMYC組間細(xì)胞凋亡率比較均存在顯著性差異(P＜0.01)。 6 pCM

13、YC-shRNA質(zhì)粒對(duì)IN500△細(xì)胞裸鼠體內(nèi)增殖的影響：裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，接種IN500△組和IN500△-pHK細(xì)胞的裸鼠成瘤率為100％，腫瘤生長(zhǎng)速度快，取材時(shí)兩組裸鼠移植瘤的平均體積分別為(563.1±40.0)mm3和(521.1±32.1)mm3，腫瘤平均質(zhì)量分別為(2.10±0.53)g和(1.87±0.35)g。接種IN500△-pCMYC細(xì)胞的裸鼠有2只未形成腫瘤，成瘤率為66.7％，腫瘤生長(zhǎng)緩慢，取材時(shí)腫瘤平均大小

14、為(224.6±28.3)mm3，平均重量為(0.60±0.12)g。單因素方差分析及SNK-T檢驗(yàn)示IN500△組和IN500△-pHK組移植瘤在體積和重量上均無(wú)顯著性差異（P＞0.05)，IN500△-pCMYC組移植瘤在體積和重量上均小于IN500△組和IN500△-pHK組，差異有顯著性(P＜0.01)。 7 pCMYC-shRNA質(zhì)粒對(duì)體內(nèi)IN500△細(xì)胞c-Myc及VEGF蛋白表達(dá)的影響：免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤中c-Myc

15、與VEGF表達(dá)結(jié)果示，IN500△組及IN500△-pHK組移植瘤中c-Myc與VEGF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞量較多，成片狀分布，IN500△組中二者平均陽(yáng)性細(xì)胞率分別為81.68％±4.22％和80.73％±3.12％，在IN500△-pHK組中分別為77.77％±3.54％和76.39％±5.74％；IN500△-pCMYC組移植瘤中c-Myc與VEGF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著降低，呈散在分布，平均陽(yáng)性細(xì)胞率分別為28.74％±1.69％和22.

16、99％±4.90％。Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)及Mann-Whiney U檢驗(yàn)示IN500△-pCMYC組移植瘤中c-Myc與VEGF蛋白的表達(dá)均低于IN500△組及IN500△-pHK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而IN500△組及IN500△-pHK組移植瘤中c-Myc與VEGF蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析示在三組移植瘤中c-Myc與VEGF表達(dá)之間均存在正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分

17、別為0.829、0.886和1.000，且各相關(guān)系數(shù)經(jīng)檢驗(yàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 8 pCMYC-shRNA質(zhì)粒對(duì)體內(nèi)IN500△細(xì)胞凋亡的影響：TUNEL法檢測(cè)裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果示，IN500△組及IN500△-pHK組移植瘤組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量少，散在分布，平均凋亡指數(shù)分別為23.44％±3.58％和24.00％±2.15％，IN500△-pCMYC組移植瘤中凋亡細(xì)胞多，灶性分布，平均凋亡指數(shù)為76.50％±2.