siRNA對HL-60細(xì)胞凋亡及c-Myc蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是新近發(fā)展起來的一種封閉基因表達(dá)的有效方法，是在mRNA水平上由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)誘發(fā)的高度特異的基因沉默機(jī)制。RNAi的基本原理是將與目的基因同源的含21～23個(gè)核苷酸的小分子干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)的一系列特異性蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNAinduced

2、silencingcomplex，RISC)，RISC以siRNA為模板特異地識別其同源性靶mRNA分子并對其進(jìn)行遞進(jìn)式剪切，形成強(qiáng)有效的瀑布效應(yīng)，誘導(dǎo)序列特異性的mRNA降解，從而導(dǎo)致該基因表達(dá)下降。RNAi技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于基因治療的研究。由于siRNA的高穩(wěn)定性及高效特異的沉默誘導(dǎo)效應(yīng)，siRNA對其靶基因所編碼的蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)優(yōu)于傳統(tǒng)的反義核酸技術(shù)。因此將siRNA應(yīng)用于白血病的研究可能為白血病的治療另辟蹊徑。 原

3、癌基因c-myc是myc家族的重要成員，其產(chǎn)物屬核蛋白類的磷酸化蛋白質(zhì)，在正常的細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程中起重要作用。c-myc原癌基因在多種人類腫瘤細(xì)胞中均有擴(kuò)增和高表達(dá)，在HL-60細(xì)胞株和白血病病人細(xì)胞中同樣存在高表達(dá)現(xiàn)象。研究表明：用反義寡核苷酸技術(shù)和RNAi技術(shù)均可封閉c-myc癌基因的異常表達(dá)，并能抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)選擇高表達(dá)c-myc的HL-60細(xì)胞作為研究對象，合成靶向c-mycmRNA的siRNA，并將

4、其導(dǎo)入HL-60細(xì)胞，觀察其對HL-60細(xì)胞生長的抑制和c-Myc蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步通過DNA電泳及流式細(xì)胞術(shù)，研究該siRNA對HL-60細(xì)胞凋亡的影響，為c-mycsiRNA作為基因藥物治療白血病提供理論依據(jù)。 方法： 1.設(shè)計(jì)并合成針對c-myc的siRNA，嚴(yán)格按照SignalSilence(R)c-MycsiRNAKit(HumanSpecific)說明書以100nM/ml的濃度轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞。同時(shí)設(shè)c

5、ontrolsiRNA組和空白對照組。 2.用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)細(xì)胞，分別計(jì)算轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h細(xì)胞生長抑制率，觀察c-mycsiRNA對細(xì)胞生長增殖的影響。 3.轉(zhuǎn)染48h后在細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 4.分別收集轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h細(xì)胞及對照組細(xì)胞，按TRIZOL試劑說明書提取細(xì)胞總蛋白，用Westernblot方法檢測c-Myc蛋白的表達(dá)情況。

6、5.轉(zhuǎn)染48h后，分別收集各組細(xì)胞，按TRIZOL試劑說明書提取細(xì)胞總DNA，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA梯狀條形帶。 6.轉(zhuǎn)染48h后收集各組細(xì)胞，按Annexin-V/FITC試劑盒說明書，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。 7.所得結(jié)果應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。方差不齊時(shí)進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換。以α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果：

7、 1.臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示：c-mycsiRNA對HL-60細(xì)胞生長的抑制隨作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)，與對照組相比，作用24h、48h及72h組均有顯著性差異(p＜0.05)。轉(zhuǎn)染48h和72h比較對HL-60細(xì)胞生長的抑制作用差別不明顯(p＞0.05)。 2.c-mycsiRNA作用48h后，形態(tài)學(xué)可見HL-60細(xì)胞生長受抑，細(xì)胞集落減少，細(xì)胞中顆粒增多，細(xì)胞碎片增多。controlsiRNA組和空白對照組細(xì)胞呈半

8、帖壁生長，細(xì)胞輪廓清楚，懸浮成團(tuán)，生長旺盛。 3.Westernblot結(jié)果顯示：與對照組相比，轉(zhuǎn)染c-mycsiRNA后，細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)水平明顯下降，且c-Myc蛋白含量隨作用時(shí)間的延長而逐漸降低，轉(zhuǎn)染24h后c-Myc蛋白含量下降約42％，48h下降66％，72h下降78％；單因素方差分析顯示與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。轉(zhuǎn)染24h組和48h、72h組比較c-Myc蛋白量有明顯差異(p＜0.05)

9、，轉(zhuǎn)染48h和72h組比較差異不大(p＞0.05)。controlsiRNA組與空白對照組比較無差異(p＞0.05)。 4.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染c-mycsiRNA48h組出現(xiàn)典型的DNA降解之梯狀條形帶，對照組未出現(xiàn)明顯凋亡梯形帶。 5.流式細(xì)胞儀分析c-mycsiRNA作用48h組細(xì)胞凋亡率可達(dá)26.21±0.75％，明顯高于controlsiRNA組(4.58±0.48％)和空白對照組(3.76±0.30％)

10、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。controlsiRNA組和空白對照組凋亡率無明顯差異。 結(jié)論： 1.c-mycsiRNA對HL-60細(xì)胞的生長和增殖有明顯的抑制作用。 2.c-mycsiRNA能降低HL-60細(xì)胞c-Myc蛋白的表達(dá)，其作用具有序列特異性和時(shí)間依賴性。 3.c-mycsiRNA使HL-60細(xì)胞出現(xiàn)明顯的DNALadder凋亡條帶，使凋亡細(xì)胞增加，故c-mycsiRNA有誘導(dǎo)HL-60