Embelin對(duì)HL60細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、前言
　　 Embelin是一種中藥提取物，最初主要用于抗感染、抗炎癥以及抗增殖等方面的研究。2004年Nikolovs等通過計(jì)算機(jī)篩選發(fā)現(xiàn)Embellin能與X-連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（Baculovirus IAP repeat，BR3）結(jié)構(gòu)域caspases的第二個(gè)線粒體激活劑（Second mitochondri

2、al activator of caspases，Smac）結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，是一種新型的XIAP小分子抑制劑。
　　 目的
　　 本研究旨在探討Emblin對(duì)人白血病細(xì)胞系HL60細(xì)胞凋亡的影響以及可能的作用機(jī)制。
　　 方法
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組
　　 人白血病細(xì)胞系HL60細(xì)胞在37℃、含5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于含10％小牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml

3、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，每2～3 d傳代1次。設(shè)5個(gè)藥物劑量組，分別為3、10、30、100及300μg/ml，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。
　　 二、MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性
　　 取對(duì)數(shù)生長期的HL60細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為1 x105/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)處理均做8個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔分別加MTT 20μl，再培養(yǎng)4 h，2000 r/min，離心10 min，棄去上清，每孔加

4、DMSO 150μL，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm的A值。按如下公式計(jì)算：細(xì)胞增殖率％=（實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A）x100％，相應(yīng)的細(xì)胞增殖抑制率％=[（對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A）/對(duì)照組A]x100％。
　　 三、Annexin V/FITC復(fù)染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率
　　 在待測(cè)細(xì)胞（1×105/ml）中加入Annexin V-FITC和PI，使其終濃度分別為50μg/ml和100μg/ml，流式細(xì)胞儀激發(fā)波長為

5、488nm。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限為正常細(xì)胞（FITC-/PI-）；右上象限為壞死細(xì)胞（FITC+/PI+）； 右下象限為凋亡細(xì)胞（FITC+/PI-）。
　　 四、JC-1染色熒光顯微鏡（單色濾光片）觀察
　　 用PBS洗滌Embelin處理后的細(xì)胞2次（離心2000rpm，5min），收集1×106的細(xì)胞，取500μl JC-1工作液將細(xì)胞均勻懸浮，37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育15-20min；室

6、溫離心（2000rpm，5min）后收集細(xì)胞，用1×Incubation Buffer洗2次；吸取500μL 1×Incubation Buffer重新懸浮細(xì)胞；滴一滴上述細(xì)胞懸液于載玻片，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察；正常細(xì)胞：單色濾光片下觀察為黃綠色；凋亡細(xì)胞：單色濾光片下觀察則為綠色。
　　 五、Western Blot分析XIAP、caspase-3及caspase-9的表達(dá)
　　 收集經(jīng)過不同處理的細(xì)胞標(biāo)本，

7、使用細(xì)胞裂解液制備細(xì)胞總蛋白，以Bradford蛋白分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白濃度。取等量總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜過夜，5％脫脂牛奶室溫封閉1h，加入XIAP（1:400）、caspase-3（1:500）及caspase-9抗體（1:500）4℃過夜，之后加入二抗室溫孵育1h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，加入顯影劑，暗室顯影。
　　 六、統(tǒng)計(jì)方法
　　 所有指標(biāo)均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 15.0軟

8、件進(jìn)行方差分析和各組間率的比較。P<0.05認(rèn)為差別有顯著性。
　　 結(jié) 果
　　 1、Embelin對(duì)HL60細(xì)胞具有增殖抑制作用，其抑制作用呈時(shí)間及劑量依賴性。其中30μg/L以上濃度的Embelin對(duì)HL60細(xì)胞的增殖抑制作用較為明顯，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），3μg/ml和10μg/ml的Embelin對(duì)HL60細(xì)胞的增殖抑制作用與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P>0.05）。顯示30μ

9、g/L以上濃度的Embelin對(duì)HL60細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。
　　 2、100μg/ml Embelin作用于HL60細(xì)胞后12、24及48h后的特異性凋亡率分別為9.23±0.05％、25.86±0.30％和39.03±0.07％，各組數(shù)據(jù)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　 JC-1染色熒光顯微鏡（單色濾光片）觀察30μg/ml Embelin作用12h后，HL60細(xì)胞為黃綠色；作用24d，時(shí)后HL60細(xì)胞為