RNA干擾技術(shù)阻斷c-fes表達(dá)對HL-60細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響.pdf

1、目的:白血病是血液系統(tǒng)最常見的一種異質(zhì)性造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,白血病的病因?qū)W已經(jīng)從群體醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)入分子生物學(xué)的研究。通過這些研究,目前較為詳盡地闡述了白血病發(fā)生過程的分化基因?qū)W說日益受到關(guān)注,該學(xué)說認(rèn)為分化基因突變可以阻止細(xì)胞的終末分化,使早期細(xì)胞堆積導(dǎo)致癌變。
　　 c-fes基因是參與并調(diào)節(jié)正常造血細(xì)胞的生成及其功能的酪氨酸激酶原癌基因,其表達(dá)與髓系分化的程度相關(guān),是一個(gè)與分化相關(guān)的基

2、因。在細(xì)胞的生長過程中,原癌基因通過基因易位、基因擴(kuò)增、插入及點(diǎn)突變等途徑被激活轉(zhuǎn)變成癌基因,使細(xì)胞獲得不死性和惡性增殖的能力。研究表明,c-fes在髓系白血病及其他腫瘤性疾病中均有表達(dá),在白血病細(xì)胞分化過程中具有重要作用,尤其在髓系細(xì)胞分化過程中的作用更為明顯,同時(shí)在凋亡途徑中具有重要作用。將特異性的c-fes反義寡核苷酸和HL-60細(xì)胞共同孵育以抑制c-fes的表達(dá),細(xì)胞并沒有分化,而是呈現(xiàn)了早期的細(xì)胞死亡,該死亡表現(xiàn)出了凋亡的形態(tài)

3、學(xué)和分子學(xué)特征。我們可以推斷c-fes基因產(chǎn)物在粒細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮了抗凋亡的作用。
　　 RNAi技術(shù)是針對轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默,能特異性地抑制如癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過度表達(dá),使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài),進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。為此,本實(shí)驗(yàn)中我們采用RNAi技術(shù)將c-fesshRNA序列轉(zhuǎn)染入HL-60細(xì)胞,初步探討下調(diào)c-fes基因表達(dá)對白血病細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響。同時(shí)進(jìn)一步觀查干擾前后不同時(shí)段,不

4、同濃度亞砷酸對HL-60細(xì)胞增殖、凋亡和分化情況的影響,探討以c-fes基因作為急性髓系白血病治療靶點(diǎn)的可行性。
　　 方法:1應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法干擾HL-60細(xì)胞的c-fes mRNA。實(shí)驗(yàn)分四組:空白對照組、脂質(zhì)體對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組、c-fes shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測c-fes蛋白,以評估轉(zhuǎn)染效率。
　　 2以不同濃度亞砷酸(0.1μmol/L、0.5μmol/L、

5、1.0μmol/L、2.0gmol/L)干預(yù)上述4組,于不同時(shí)段(0h、24h、48h、72h)采用RQ-PCR.技術(shù)檢測c-fes rnRNA水平變化,采用瑞式染色觀察細(xì)胞的生長情況,采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)了解細(xì)胞增殖抑制情況,NBT還原實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞分化,應(yīng)用Annexin-V/FITC檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果:1 c-fes shRNA轉(zhuǎn)染抑制了c-fes蛋白的表達(dá):FCM結(jié)果顯示c-fes shRNA可顯著下調(diào)c-fes mR

6、NA的表達(dá),且對c-fes蛋白的下調(diào)從干擾后12h即出現(xiàn),最高下調(diào)率為76.36％,出現(xiàn)在干擾后48h,但持續(xù)時(shí)間較短,72h后c-fes蛋白略有回升。
　　 2 c-fes shRNA組經(jīng)As2O3(0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L)誘導(dǎo)后,細(xì)胞更早地呈現(xiàn)染色質(zhì)固縮,核碎裂等凋亡特征,最為明顯的是在濃度為2.0μmol/L的As2O3處理后在72h即出現(xiàn)了凋亡特征性的高峰改變,可見

7、細(xì)胞核染色質(zhì)凝集,核邊集,細(xì)胞被分裂成數(shù)個(gè)質(zhì)膜包裹的小體即凋亡小體,而且隨著作用時(shí)間的延長,視野中的活性細(xì)胞逐漸減少,凋亡細(xì)胞相應(yīng)增多。
　　 3 CON組、LIP組及KB組隨著As2O3濃度的增加和時(shí)間的延長,RQ-PCR檢測顯示c-fes mRNA的表達(dá)水平均呈逐漸增強(qiáng)趨勢,但三組之間c-fesmRNA表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。C-fes shRNA組在與低濃度(0.1μmol/L、0.5μmol/L)As2O3處

8、理不同時(shí)段(0h、24h、48h、72h)后,c-fes mRNA表達(dá)水平均未升高。72h后c-fes mRNA的表達(dá)水平略有回升,但仍舊比同時(shí)期的CON組、LIP組及KB組低。
　　 4 CON組、LIP組、KB組的之間的細(xì)胞抑制率、細(xì)胞分化指數(shù)、細(xì)胞凋亡指數(shù)均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 5 CON組、LIP組及KB組HL-60細(xì)胞隨著As2O3濃度的增加,白血病細(xì)胞的增殖抑制率呈明顯升高趨勢,c-fes s

9、hRNA組HL-60細(xì)胞隨著As2O3濃度的增加及作用時(shí)間的延長,白血病細(xì)胞的抑制率又顯著高于同期對照組(P＜0.05)。
　　 6 As2O3在0.1μmol/L、0.5μmol/L濃度時(shí)對CON組、LIP組、KB組的HL-60細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)分化作用,并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性的量效關(guān)系。As2O3在0.1μmol/L、0.5μmol/L時(shí),c-fes shRNA組HL-60細(xì)胞在12h時(shí)分化指數(shù)與未經(jīng)任何處理的H

10、L-60細(xì)胞無顯著性差異(P＞0.05),24h、48h時(shí)分化指數(shù)降低,到48h時(shí)分化指數(shù)降到最低,明顯低于未經(jīng)任何處理的HL-60細(xì)胞,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。在1.0μmol/L、2.0μmol/L濃度的As2O3誘導(dǎo)下,分化指數(shù)一直處于較低水平,在24h時(shí)分化指數(shù)降到最低。
　　 7用流式細(xì)胞儀與Annexin-V/FITC試劑盒檢測,c-fes shRNA組經(jīng)As2O3(0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.

11、0μmol/L、2.0μmol/L)誘導(dǎo)后,FITC+/PI-和FITC+/PI+細(xì)胞數(shù)顯著增加,顯著高于同期對照組(P＜0.05)。其中在2.0μmol/L的濃度下,24h時(shí)FITC+/PI和FITC+/PI+細(xì)胞數(shù)明顯增加,達(dá)到了41.36％。
　　 結(jié)論:1 c-fes shRNA序列阻斷了HL-60細(xì)胞c-fes mRNA表達(dá),成功地使c-fes的表達(dá)水平受抑制,有效地阻滯了HL-60的分化和增殖,誘導(dǎo)了HL-60細(xì)胞的