拓撲替康對HL-60細胞的增殖抑制及誘導凋亡的作用.pdf

1、目的：DNA拓撲異構酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ，TopoⅠ)，是生物體內極其重要的細胞核內酶，參與DNA復制、轉錄、重組和修復等關鍵的過程。拓撲替康(topotecan，TPT)是一種新的水溶性、半合成喜樹堿(Camptothecin，CPT)衍生物，它以TopoⅠ為靶點，通過與Topo-Ⅰ和DNA形成三重復合物，阻止DNA轉錄及復制等過程，發(fā)揮其獨特的抗癌作用。TPT作為新一代的TopoⅠ抑制劑，目前已被廣泛試用于血液系統(tǒng)惡性

2、疾病的治療。原癌基因c-myc是myc家族的重要成員，其編碼的磷酸化蛋白質屬核蛋白類，對正常細胞的增殖、分化、凋亡起重要作用。研究表明c-myc在HL-60細胞株和白血病病人的白血病細胞中均高表達，可能與白血病的發(fā)生、病程演變及預后等密切相關。有資料顯示抑制c-myc基因的表達，可以誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。雖然TPT在治療白血病等惡性血液病的臨床實驗中已顯示了明顯的抗腫瘤活性，但對其作用的分子機理尚不清楚，TPT對白血病細胞的作用及

3、其與c-myc之間的關系有待探討。本實驗旨在研究TPT誘導白血病細胞凋亡的作用及TPT抑制內源性c-mycmRNA及其蛋白的表達效果，為進一步了解TPT對腫瘤細胞的作用機制，提高TPT的臨床療效提供有意義的實驗資料。 材料與方法：1.白血病細胞系HL-60由鄭州大學醫(yī)學院組胚教研室提供。 2.采用四甲基偶氮唑鹽光吸收法(MTT法)檢測0.05、0.10、0.15、0.20μmol/L的TPT分別作用于HL-60細胞后4h

4、、8h、12h、16h的增殖情況，計算各組細胞的增殖抑制率，并找出TPT作用HL-60細胞的最適時間和最適濃度。倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)及形態(tài)學改變。 3.采用流式細胞儀技術(AnnexinVFITC分析法)檢測細胞凋亡率；原位酶標記技術(TUNEL技術)檢測細胞的凋亡情況。 4.采用RT-PCR方法檢測TPT對HL-60細胞c-mycmRNA表達的影響；用免疫組化方法檢測TPT對HL-60細胞C-myc蛋白表達的影響

5、。 5.所得結果應用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件處理，統(tǒng)計學數據用均數±標準差((x)±s)表示。兩樣本均數的比較采用獨立樣本的T檢驗，多樣本均數的比較采用單因素方差分析。兩樣本率的比較采用四格表資料的x2檢驗。以α=0.05作為檢驗水準。 結果：1.藥物對HL60細胞增殖的抑制作用采用MTT比色法檢測結果顯示：同一時間點不同濃度的TPT(0.05、0.10、0.15、0.20μmol/L)對HL-60細胞的抑制作用，與空

6、白對照組比較，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；0.20μmol/L與0.15μmol/L的藥物對HL-60細胞生長的抑制作用無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。同一濃度TPT在不同時間點(4h、8h、12h、16h)對HL-60細胞的抑制作用與對照組相比較，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。TPT作用HL-60細胞16h與12h的抑制率無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?？偟膩碚fTPT抑制HL-60細胞生長具有劑量和時間的依賴性，其作用的最適濃度為0

7、.15μmol/L，最適時間為12h。 2.TPT對HL-60細胞的誘導凋亡作用流式細胞儀技術(AnnexinVFITC分析法)研究了磷脂酰絲氨酸(PS)轉位，結果顯示：0.15μmol/LTPT作用于HL-60細胞4h，細胞凋亡率為(28.57±3.16)％與空白對照組比(3.12±0.38)％，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。TUNEL結果顯示：采用0.15μmol/LTPT作用HL-60細胞12h后，檢測陽性細胞數并計

8、算陽性表達率發(fā)現，TPT對HL-60細胞具有明顯的誘導凋亡作用，與空白對照組相比具有統(tǒng)計學意義(38.33％對2.67％，P＜0.05)。 3.TPT對HL-60細胞c-myc基因mRNA及蛋白表達的影響RT-PCR結果顯示：0.15μmol/LTPT作用于HL-60細胞12h后，c-mycmRNA的表達水平明顯下調至(0.17±0.03)，與空白對照組相對表達量相比較(1.11±0.25)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。