依托咪酯誘發(fā)HL-60細(xì)胞凋亡以及預(yù)處理對(duì)其的抑制作用.pdf

1、目的：細(xì)胞凋亡存在于多種生理病理過(guò)程，對(duì)于細(xì)胞凋亡的研究可闡明疾病的發(fā)生機(jī)制，探索疾病新的治療方法和手段。依托咪酯作為一種靜脈麻醉藥，對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響小，且具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。但是依托咪酯具有降低皮質(zhì)醇的作用，因此它的使用受到了一定的關(guān)注。實(shí)驗(yàn)證實(shí)依托咪酯直接抑制11-β-羥化酶(一種合成皮質(zhì)醇必需的酶)的活性，誘導(dǎo)劑量(0.3mg/kg)的依托咪酯產(chǎn)生的腎上腺抑制作用可達(dá)5-8小時(shí)。皮質(zhì)醇的血漿濃度降低自然影響下丘腦-垂體-腎上腺

2、軸的調(diào)節(jié)功能，影響機(jī)體對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)，對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生間接的抑制作用。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)依托咪酯可以通過(guò)抑制T-淋巴細(xì)胞增殖及粒細(xì)胞功能，直接影響免疫系統(tǒng)。 因此，我們從細(xì)胞凋亡的角度，探索依托咪酯的副作用，具有藥理學(xué)意義和臨床意義。人急性髓性細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL-60細(xì)胞)保持著中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的某些免疫特征，而且該細(xì)胞株是用于凋亡研究的典型標(biāo)準(zhǔn)株，其凋亡的多種生化反應(yīng)步驟已得到確立。觀察依托咪酯對(duì)HL-60細(xì)胞的作用，既可以反映依

3、托咪酯對(duì)免疫細(xì)胞的直接作用，又有利于研究其具體的凋亡機(jī)制。此外，本研究用小劑量的依托咪酯預(yù)處理HL．60細(xì)胞，觀察此方法是否對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡具有抑制作用，以便尋找降低依托咪酯副作用的新途徑。 方法：正常培養(yǎng)HL-60細(xì)胞，濃度調(diào)節(jié)至1.5×10<'5>/ml，按照不同的處理方法進(jìn)行分組：1．對(duì)照組：僅在無(wú)依托咪酯的正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h；2．預(yù)處理組：用含1μM依托咪酯的培養(yǎng)基預(yù)處理1h，洗去依托瞇酯后在培養(yǎng)基中恢復(fù)4h，再

4、用含500μM依托咪酯的培養(yǎng)基刺激24h；3．損傷組：僅用含500μM依托咪酯的培養(yǎng)基刺激24h。收集細(xì)胞后，分別用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，AnnexinV-PI雙染流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western Blot法檢測(cè)caspase-3，8，9的活化。結(jié)果：1．MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，預(yù)處理組和損傷組的細(xì)胞生存率均有下降；但與損傷組相比，預(yù)處理組的細(xì)胞生存率增高35.35﹪，具有顯著性差異，p<0.01。2．Annexin V

5、-PI雙染流式細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，預(yù)處理組和損傷組的早期凋亡率和死亡率(1-活細(xì)胞率)有所升高；而與損傷組相比，預(yù)處理組的早期凋亡率和死亡率分別降低27.48﹪和20.23﹪，有顯著性差異，P<0.01。3．WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，依托咪酯刺激后，procaspase-3發(fā)生活化，表達(dá)減少，而caspase-8、9活化片段的表達(dá)增多；但是預(yù)處理組比損傷組的procaspase-3表達(dá)增多，casp