姬松茸子實體多糖對人白血病細胞HL-60細胞的抑制作用及其機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　盡管不同治療策略的發(fā)展，白血病依舊是最常見的血液系統惡性腫瘤，并且是人類死亡的主要原因。近年來，白血病發(fā)病率和死亡率不斷上升，針對白血病治療藥物的研究越來越重要。姬松茸，又稱為巴西蘑菇，中國也稱為梁金菇，經過體外和體內的研究，發(fā)現具有包括抗腫瘤、抗病毒、抗炎、保肝、降糖、降脂、抗動脈粥樣硬化、抗過敏和免疫調節(jié)等作用。越來越多的證據表明，從姬松茸子實體中提取的多糖和多糖蛋白復合物在治療和預防癌癥上，有著很重要的生物活

2、性作用。但是，到目前為止，對于姬松茸子實體多糖對人早幼粒白血病細胞HL-60細胞體外和體內作用的具體機制，還沒有系統的說明?？紤]到這一點，我們研究了姬松茸多糖體外對人早幼粒白血病細胞HL-60增殖和凋亡的影響和研究多糖的體內抑制腫瘤生長的作用。
　　細胞凋亡信號轉導通路主要有兩條:內源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑，兩者最終都通過激活凋亡執(zhí)行分子:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinylaspartate specif

3、ic protease，Caspase)來實現。線粒體是細胞凋亡信號轉導途徑中起關鍵其作用的細胞器。Bcl-2家族蛋白例如抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白和促凋亡蛋白Bax蛋白在細胞凋亡的調節(jié)過程中尤其是線粒體途徑中起非常重要的作用。在內源性線粒體途徑中，當細胞接到凋亡信號刺激，Bax可從細胞質轉位到線粒體膜上，在線粒體膜上形成四聚體到十聚體組成的低聚復合物上，導致線粒體跨膜電位的丟失，介導細胞色素-c等物質的釋放，細胞色素-c從線粒體膜間釋放

4、到細胞漿中，與凋亡蛋白酶激活因子-1(Apoptotic protease activating factor，Apaf-1)結合，形成凋亡體，激活Caspase-9再激活Caspase-3，啟動Caspase-3級聯反應，誘導細胞凋亡。因此，通過線粒體途徑誘導腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤研究的一個熱點。
　　目的:
　　1.姬松茸是食藥兼用的真菌，它的抗腫瘤活性，已被廣泛的應用。多糖是姬松茸治療腫瘤的主要化學成分，從姬松茸子實體中

5、提取，純化出姬松茸多糖，來研究它的醫(yī)學價值。
　　2.通過觀察姬松茸多糖在體外對HL-60細胞的作用，探討姬松茸多糖抑制HL-60生長的具體機制。
　　3.通過構建裸鼠移植瘤模型，通過給裸鼠注射多糖樣品，來觀察其抑制腫瘤生長的效應，檢測多糖對腫瘤細胞的殺傷或清除作用，通過計算抑瘤率等指標來確定多糖的作用效果。
　　方法:
　　1.本實驗按照文獻略加改進將500g姬松茸子實體用熱水提取、Sevage法除蛋白、乙醇沉

6、淀、離子交換層層析提純后得到姬松茸多糖，酚-硫法檢測多糖的含量。
　　2.姬松茸多糖體外誘導白血病細胞凋亡作用實驗研究。
　　(1)通過MTT實驗觀察姬松茸多糖對HL-60細胞的作用。
　　(2)流式細胞技術（AnnexinⅤ/PI雙染）檢測姬松茸多糖誘導HL-60細胞凋亡的效應。
　　(3) Caspase-3活性檢測試劑盒檢測姬松茸多糖處理后的HL-60細胞，發(fā)現Caspase-3活性的變化。
　　3.

7、姬松茸多糖誘導HL-60細胞凋亡具體機制的研究。
　　(1)采用流式細胞技術檢測經姬松茸多糖處理后的HL-60細胞線粒體膜電位變化情況。
　　(2)采用Western blotting方法檢測經姬松茸多糖處理后的HL-60細胞細胞色素c(Cyt-c)、Bax蛋白、Bcl-2蛋白、聚-ADP-核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase，PARP)蛋白的變化。
　　4.姬松茸多糖在體內對裸鼠移植瘤模型

8、腫瘤的作用。
　　為了觀察姬松茸多糖在體內對白血病細胞的作用，我們通過皮下接種HL-60細胞構建人白血病細胞裸鼠異種移植瘤模型，隨機分成生理鹽水組，治療組、和環(huán)磷酰胺組，定期測量裸鼠體重，觀察裸鼠狀態(tài)和不良反應，最后，處死裸鼠，稱量腫瘤的重量，通過計算抑瘤率等指標來確定多糖的作用效果。
　　結果:
　　1.500g姬松茸子實體分離純化獲得42.4g粗多糖，經過分離純化得到其中一種多糖，用酚硫法檢測其中的多糖含量為89.

9、2％
　　2.通過MTT試驗發(fā)現姬松茸多糖對HL-60細胞的增殖有抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強，具有一定的量效關系。
　　3.流式細胞技術（AnnexinⅤ/PI雙染）檢測姬松茸多糖誘導人早幼粒白血病細胞株HL-60細胞凋亡的效應，發(fā)現隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡率增加，呈現一定的量效關系。
　　4.通過Caspase-3活性檢測試劑盒檢測經姬松茸多糖處理后的HL-60細胞，Caspase-3活性增加

10、，并且隨著藥物濃度的增加，活性增強，呈現一定的量效關系。
　　5.流式細胞技術檢測經姬松茸多糖處理后的HL-60細胞線粒體膜電位變化情況，發(fā)現隨著藥物濃度的增加，線粒體膜電位丟失增多，呈現一定的量效關系。
　　6.Western blotting檢測發(fā)現，姬松茸多糖誘導HL-60細胞中細胞色素c從線粒體中釋放至細胞漿中，細胞漿中的細胞色素c增加，促凋亡因子Bax蛋白增加，同時抗凋亡蛋白Bcl-2沒有明顯變化，導致Bax/Bc

11、l-2比值增加，促進細胞凋亡發(fā)生。
　　7.Western blotting檢測發(fā)現，姬松茸多糖處理后的HL-60細胞，被剪切成89KD的PARP增加，并且均隨著藥物濃度的增加，反應增強，呈現一定的量效關系。
　　8.姬松茸多糖裸鼠體內抑制HL-60細胞移植瘤的生長。姬松茸多糖組裸鼠腫瘤生長受到顯著抑制，而體重無明顯差異，未觀察到明顯毒副反應，并且隨著治療劑量的增加，抑制腫瘤生長的作用增強，具有一定的劑量依賴性。提示姬松茸多

12、糖在一定的劑量和療程內具有高效、低毒的抗白血病效應。
　　結論:
　　1.從姬松茸子實體中通過熱水提取、乙醇沉淀、離子交換層層析提純后，可以得到姬松茸多糖。
　　2.姬松茸多糖在體外能有效的抑制HL-60細胞的增殖，同時這種抑制細胞增殖作用是通過誘導細胞凋亡產生的，因此姬松茸多糖在體外有較強的體外抗白血病效應。
　　3.本研究探明了姬松茸多糖誘導白血病細胞凋亡的機制是通過Caspase依賴的線粒體途徑調節(jié)的:在姬