丙戊酸鈉抑制白血病HL-60細(xì)胞增殖的實驗研究.pdf

1、研究背景： 急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一。聯(lián)合化療是治療AML的主要方法之一，但治療效果不盡人意。研究認(rèn)為，基于AML發(fā)病機(jī)制和耐藥機(jī)制而開發(fā)的靶向治療是AML治療取得突破的希望所在。組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)是其中的一種靶向藥物。 腫瘤的發(fā)生與基因組的改變有關(guān)。組蛋白去乙酰

2、化酶(Histone deacetylase，HDAC)參與組蛋白周圍DNA卷曲/不卷曲的部分進(jìn)程，是基因表達(dá)的前提條件。HDAC可以使核小體中的組蛋白過度去乙?；?，后者與核小體DNA緊密結(jié)合，抑制分化相關(guān)基因和抑癌基因等多種基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與多種腫瘤的發(fā)生。因此，抑制HDAC的異常活動所致的基因轉(zhuǎn)錄異常成為包括白血病在內(nèi)的腫瘤治療的方向之一。 丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)是臨床治療癲癇的常用藥物，為短鏈脂肪

3、酸丙戊酸的鈉鹽，在臨床用藥劑量范圍內(nèi)能夠抑制HDAC活性，屬于HDACIs。與其他HDACIs相比，VPA的半衰期長，生物利用性較好及有效血藥濃度較低，臨床應(yīng)用毒副作用輕微，可以很好地被病人耐受，成為有臨床應(yīng)用前景的新型抗腫瘤藥物。國外臨床試驗發(fā)現(xiàn)VPA可通過上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控因子P21cip1、P27Kip1的表達(dá)及下調(diào)Bcl—2的表達(dá)使細(xì)胞周期停滯及細(xì)胞凋亡，單獨(dú)或聯(lián)合5-氮雜胞苷、全反式維甲酸對難治復(fù)發(fā)的AML有較好的治療效果，能逆

4、轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥，且副作用小、耐受性好。本課題組的前期實驗中，也發(fā)現(xiàn)VPA可誘導(dǎo)白血病HL—60細(xì)胞凋亡，但具體機(jī)制還待進(jìn)一步探討。 研究表明，端?！肆Ｃ赶到y(tǒng)對白血病等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要的作用。端粒是真核細(xì)胞染色體末端短的重復(fù)的DNA序列組成的特殊結(jié)構(gòu)，對維持染色體的完整性及穩(wěn)定性有重要作用。大多數(shù)正常體細(xì)胞沒有端粒酶活性，端粒隨細(xì)胞分裂而進(jìn)行性縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。在腫瘤細(xì)胞中，端粒酶處于激活狀態(tài)，能識別并結(jié)合于端

5、粒末端，以自身RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄合成DNA的方式延伸端粒，使端粒長度保持穩(wěn)定，抑制細(xì)胞凋亡及衰老，導(dǎo)致細(xì)胞“永生化”。在組成端粒酶的成分中，催化亞單位——端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是調(diào)控端粒酶活性的關(guān)鍵所在，是端粒酶激活的限速因子。多項研究表明hTERT的表達(dá)僅限于腫瘤細(xì)胞，且其表達(dá)與端粒酶的活性平行。在造血系統(tǒng)疾病中急性白血病端粒酶活性最強(qiáng)，初治患者

6、較非惡性血液系統(tǒng)疾病患者端粒酶活性高，治療緩解后活性降低，復(fù)發(fā)期端粒酶活性又明顯升高。研究發(fā)現(xiàn)，曲古抑菌素A(trichostatinA, TSA)、丁酸鈉等HDACIs可使hTERT轉(zhuǎn)錄受抑，進(jìn)而導(dǎo)致端粒酶活性下降，引起腫瘤細(xì)胞凋亡。但也有人報道HDACIs對端粒酶活性無明顯影響，甚至有研究者觀察到HDACIs可上調(diào)端粒酶活性。VPA作為一個較有臨床應(yīng)用前景的HDACIs，能否影響AML細(xì)胞端粒酶活性及其可能的調(diào)控途徑如何，其抑制AM

7、L細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)與端粒酶有無關(guān)系，目前國內(nèi)外未見有文獻(xiàn)報道。 本課題擬通過檢測VPA對人類AML細(xì)胞株HL—60細(xì)胞增殖、凋亡、hTERT mRNA等的影響，探討VPA是否可以通過干預(yù)端粒酶活性抑制AML細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，為AML的治療提供新的思路。 實驗材料與方法： 1.細(xì)胞來源 人急性髓細(xì)胞白血病敏感細(xì)胞株HL—60細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所。 2.實驗方法 ①

8、VPA與HL—60細(xì)胞共同孵育后，利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，CCK—8法檢測不同濃度的VPA作用不同時間后細(xì)胞的增殖情況。 ②Hoechst33258染色及流式細(xì)胞儀檢測VPA作用后細(xì)胞凋亡情況。 ③流式細(xì)胞儀檢測VPA作用后細(xì)胞周期的變化。 ④Real—time PCR定量檢測VPA作用前后細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)。 ⑤Western—blot方法檢測細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl—2、Ba

9、x、c—Myc的表達(dá)； ⑥分光光度法檢測藥物作用前后細(xì)胞中caspase—3酶活性的變化。 3.統(tǒng)計學(xué)分析 計量數(shù)據(jù)的描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(-x±s)；兩獨(dú)立樣本均數(shù)的比較用t檢驗，多組資料間均數(shù)的比較用單因素方差分析；兩個變量間的相關(guān)性分析采用Pearson方法。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理，檢驗水準(zhǔn)定為P≤0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、VPA對HL—60細(xì)胞增殖的影響。與陰

10、性對照組相比，VPA對HL—60細(xì)胞有不同程度的增殖抑制作用，并且具有劑量和時間效應(yīng)規(guī)律。VPA作用48時，對HL—60細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentrationg50，IC50)值為3.23mmol/L。 2、VPA誘導(dǎo)HL—60細(xì)胞凋亡。VPA作用后，熒光顯微鏡下觀察HL—60細(xì)胞，可見到典型的凋亡小體。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，VPA處理48h后，HL—60細(xì)胞的凋亡率在對照組、1 mmol/L組、2mm

11、ol/L組、4mmol/L組分別為(7.80±1.29)％、(18.97±0.56)％、(38.64±0.84)％、(63.81±2.17)％，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 3、VPA對HL—60細(xì)胞周期的影響。VPA作用48h后，隨著藥物濃度的增高，處于G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增高，S期的細(xì)胞比例下降，提示VPA可以將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。 4、VPA降低HL—60細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)。

12、VPA作用48h后，HL—60細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)在對照組、1mmol/L組、2mmol/L組、4mmol/L組分別為(1.00±0.04)、(0.90±0.03)、(0.73±0.03)、(0.48±0.01)。各組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示隨著VPA濃度升高，hTERT mRNA表達(dá)逐漸下降。 5、hTERT mRNA表達(dá)與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計，VPA作用后，hTERTmRNA的表達(dá)與HL—6

13、0細(xì)胞凋亡率的相關(guān)系數(shù)r=—0.91(P<0.05)，即細(xì)胞凋亡與hTERT mRNA表達(dá)存在內(nèi)在聯(lián)系，hTERT mRNA表達(dá)減少可能引起細(xì)胞凋亡增多。 6、VPA對HL—60細(xì)胞Bcl—2、Bax、c—Myc蛋白表達(dá)的影響。隨VPA濃度的增加，Bcl—2、c—Myc蛋白條帶亮度逐漸減弱，而Bax蛋白條帶亮度逐漸增強(qiáng)，與內(nèi)參β—actin比較進(jìn)行半定量分析，結(jié)果提示VPA可濃度依賴性地下調(diào)Bcl—2、c—Myc蛋白的表達(dá)，上調(diào)

14、Bax蛋白的表達(dá)，各濃度組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 7、VPA可增強(qiáng)HL—60細(xì)胞caspase—3酶的活力。VPA作用48h后，HL—60細(xì)胞的caspase—3酶活力在對照組、1mmol/L組、2mmol/L組、4mmol/L組逐漸增高，各組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： 1.VPA可劑量、時間依賴性抑制HL—60細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 2.VPA對HL—60細(xì)胞有周期

15、抑制作用，可將細(xì)胞阻滯于G0-G1期。 3.VPA可抑制端粒酶亞單位hTERT mRNA表達(dá)水平，hTERT mRNA表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)。 4.VPA可通過下調(diào)Bcl—2、c—Myc蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)和增強(qiáng)caspase—3活性，誘導(dǎo)HL—60細(xì)胞凋亡。 5.VPA抑制HL—60細(xì)胞增殖可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子Bcl—2、Bax、c—Myc、caspase—3表達(dá)、阻滯細(xì)胞周期和下調(diào)端粒酶活性等機(jī)