Survivin基因RNAi真核表達載體對HL-60細胞的抑制作用.pdf

1、目的:白血病是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤,細胞增殖與細胞凋亡失衡是其發(fā)生的主要原因之一.Survivin是細胞凋亡抑制蛋白家族(Inhibtor of Apoptosis Family ofProteins,IAPs)新成員之一,其表達具有高度特異性,在正常成年組織不表達而在多種腫瘤中高表達,而且survivin的表達與腫瘤的惡性程度及患者的預后密切相關(guān)<'[1,2]>.RNA干擾(RNA interference,RNAi)是雙鏈RNA(do

2、uble-strandedRNA,dsRNA)分子在mRNA水平封閉相應序列基因的表達使其沉默的過程,是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS).RNAi是生物體抵抗病毒入侵、調(diào)控基因表達的監(jiān)控機制.RNAi介導的基因沉默已經(jīng)成為一種快速有效地研究基因功能和基因治療的手段.本實驗利用轉(zhuǎn)錄載體pSINsi-Hu6構(gòu)建靶向survivin基因的短發(fā)夾狀RaNA(short hairpin RNA,shRNA)的真核表達載體,研究其在白血病

3、細胞株HL-60中對細胞增殖和凋亡的影響,為進一步研究沉寂survivin基因用于白血病細胞的基因治療提供實驗室依據(jù). 方法: 1.構(gòu)建針對survivin基因的shRNA真核表達載體,即pSIN/shRNA. 2.實驗分組:實驗分為轉(zhuǎn)染組,陰性對照組,空白對照組; 3.采用RT-PCR法檢測pSIN/shRNA對HL-60細胞對survivin mRNA表達的影響;免疫組化法檢測pSIN/shRNA對H

4、L-60細胞survivin蛋白表達的影響. 4.采用四甲基偶氮唑鹽光吸收法(MTI法)檢測pSIN/shRNA轉(zhuǎn)染HL-60增殖情況. 5.應用流式細胞儀Annexin v-FITC/PI法檢測細胞凋亡. 6.統(tǒng)計學處理所有結(jié)果以均數(shù)士標準差(x±s)表示,應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),采用單因素方差分析(ANOVA.),以a=0.05作為檢驗水準.結(jié)果:1.重組質(zhì)粒的酶切及測序鑒定:用限制性內(nèi)切酶Ba

5、mH I、Cla I雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳顯示:重組載體可產(chǎn)生5606bp和63bp的片斷,而空載體產(chǎn)生6522bp的DNA片斷.重組質(zhì)粒經(jīng)自動基因測序儀測序(上海申能博彩生物公司),結(jié)果與設(shè)計序列完全相符,所含目的基因序列準確無誤,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.2.pSIN/shRNA對:HL-60細胞survivin mRNA及Survivin蛋白表達的影響:RT-PCR.結(jié)果顯示:4.Oμg pSIN/shRNA轉(zhuǎn)染HL-60細胞24、48

6、、72、96h后,轉(zhuǎn)染各時間組與空白對照組和陰性對照組相比,對目的基因mRNA表達水平下調(diào)有顯著性差異(P<0.01),陰性對照組與空白對照組間無顯著性差異(P>0.05).轉(zhuǎn)染各時間組組間比較,轉(zhuǎn)染24h組對目的基因mRNA表達下調(diào)水平明顯低于48、72、96h組,有顯著性差異(P>0.05).48h、72h、96h間無顯著性差異(P>0.05).免疫組化結(jié)果顯示:4.0μg pSIN/shRNA作用HL-60細胞48h后,空白對照組

7、與陰性對照組Survivin蛋白HL-60細胞中表達陽性積分為(147.32±13.71)和(142.33±14.43),轉(zhuǎn)染組Survivin蛋白表達明顯降低,積分為(50.33±7.33).兩對照組間積分均顯著高于轉(zhuǎn)染組,與轉(zhuǎn)染組相比有顯著性差異(P<0.01),兩對照組間積分無明顯差異(P>0.05).3.pSIN/shRNA對HL-60細胞的增殖抑制作用MTT法檢測結(jié)果顯示:4.0μg pSIN/shRNA轉(zhuǎn)染細胞后,每24小時

8、檢測各組細胞,連續(xù)檢測72小時,觀察pSIN/shRNA對HL-60細胞的增殖抑制作用,24h開始出現(xiàn)抑制作用,48h抑制作用最強,轉(zhuǎn)染各時間組與空白對照組及陰性對照組比較,對HL-60細胞的增殖抑制作用均有統(tǒng)計學意義(P<0.01),陰性對照組與空白對照組間無差異(P>0.05).轉(zhuǎn)染各時間組組間比較,24h組與48、72h組間比較對HL-60細胞的增殖抑制作用差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),48、72h組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0

9、.05).本實驗表明,pSIN/shRNA對HL-60細胞的增殖抑制作用有時間依賴性和序列特異性,其作用最佳時間為48h.4.pSIN/shRNA誘導HL-60細胞凋亡的作用:轉(zhuǎn)染4.0μg pSIN/shRNA 48h后,pSIN/shRNA組胞凋率可達(20.21±O.75)﹪,明顯高于陰性對照組的(2.58±0.48)﹪和空白對照組的(1.26±0.30)﹪,有統(tǒng)計學意義,(P<0.01).陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義