Survivin特異性小發(fā)夾RNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對HL-60細(xì)胞的影響.pdf

1、RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由siRNA(small interfering RNA,siRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默.作用機(jī)制包括起始階段和效應(yīng)階段,在起始階段,雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)在Dicer酶的作用下,被降解為21～23堿基的siRAN.在效應(yīng)階段,siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成RNA誘導(dǎo)活化沉默復(fù)合物(RNA-indtreed silencing

2、 complex,RISC),激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上,從而導(dǎo)致mRNA降解,出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默.RNAi自1998年被發(fā)現(xiàn)以來,國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行了大量的研究工作,證實(shí)了RNAi技術(shù)不僅基因抑制效果確切,而且有嚴(yán)格的序列特異性,治療針對性強(qiáng),副作用小.到目前為止,該技術(shù)已在多種惡性腫瘤和白血病細(xì)胞的研究中應(yīng)用,均顯示出良好的基因沉默效果.因此,RNAi是目前基因治療的良好手段. Survivn基因

3、是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptotic protein,IAP)成員之一,位于17q25染色體,基因長度為14.7kb,能編碼142個氨基酸組成的分子量約為16.5kD的胞質(zhì)蛋白.它的BIR結(jié)構(gòu)域可以通過抑制caspase-3和caspase-7而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.國內(nèi)外研究證實(shí),survivin在正常成人組織中不表達(dá),而在惡性腫瘤細(xì)胞及白血病細(xì)胞中高表達(dá),并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān).文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),應(yīng)用反義寡核苷

4、酸技術(shù)和RNAi技術(shù)沉默survivin基因可以導(dǎo)致其他惡性腫瘤細(xì)胞凋亡.因此,survivin可能成為白血病基因治療的一個新靶點(diǎn). 白血病是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤,發(fā)病率高,惡性度強(qiáng),嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量.20世紀(jì)80年代以來,白血病的治療取得了較大的進(jìn)展,大劑量化療、造血干細(xì)胞移植及免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用,大大提高了白血病患者的生存率.但大劑量化療具有嚴(yán)重的毒副作用,造血干細(xì)胞移植費(fèi)用昂貴,且具有移植物抗宿主病等并發(fā)癥,限制了其臨

5、床廣泛應(yīng)用. 有研究顯示以RNA干擾沉默BCR/ABL基因可以促進(jìn)CML細(xì)胞株K562細(xì)胞凋亡、抑制其增殖.但以RNA干擾沉默survivin基因?qū)Π籽』蛑委煹难芯繄?bào)導(dǎo)較少,本研究通過構(gòu)建Survivin特異性小發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表達(dá)載體、利用Lipofectamine 2000<'TM>脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到HL-60細(xì)胞.研究survivin基因?qū)Π籽〖?xì)胞的增殖、蛋白表達(dá)及凋亡的影響

6、.旨在為以Survivin基因?yàn)榘悬c(diǎn),RNA干擾為手段的白血病和其他惡性腫瘤的基因治療的研究提供技術(shù)手段和理論基礎(chǔ). 方法: (1)構(gòu)建survivin特異性shRNA真核表達(dá)載體,同時構(gòu)建survivin非特異性真核表達(dá)載體. (2) 實(shí)驗(yàn)分三組:survivin特異性shRNA真核表達(dá)載體作用組(轉(zhuǎn)染組)、survivin非特異性真核表達(dá)載體作用組(陰性對照組)、未做處理的HL一60細(xì)胞組(空白對照組).

7、 (3)用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60. (4)用臺盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)細(xì)胞,分別計(jì)算轉(zhuǎn)染后24h,48h和72h細(xì)胞生長抑制率,觀察SLlrvivin siRNA對細(xì)胞生長增殖的影響.' (5)分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72hL收集各組細(xì)胞,TRIZOL法提取蛋白,Western-blot方法測定細(xì)胞轉(zhuǎn)染后survivin蛋白變化. (6)利用原位酶標(biāo)

8、記檢測法(TLJNEL)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HL-60細(xì)胞的凋亡狀況. (7)所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)數(shù)資料采用X<'2.檢驗(yàn).計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多樣本均數(shù)比較采用方差分析.方差不齊時進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換.檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 結(jié)果: (1)經(jīng)酶切鑒定和基因測序證實(shí):survivin特異性及非特異性shRNA真核表達(dá)載體與設(shè)計(jì)完全一致,所含目的基因序列

9、準(zhǔn)確無誤.(2) 臺盼藍(lán)細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染survivin特異性小發(fā)夾RNA真核表達(dá)載體后,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長受到明顯抑制,且隨作用時間的延長而增強(qiáng),其轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h的生長抑制率分別為17.6±8.5﹪、38.3±4.2﹪、44.0±1.2﹪.轉(zhuǎn)染組與陰性對照組和空白對照組生長抑制率相比,作用24h,48h及72h組均有顯著性差異(p<0.01).轉(zhuǎn)染組24小時與48d,時和72小時相比均有顯著性差異(P<0.01)

10、,轉(zhuǎn)染組48h和72h以及空白對照組和陰性對照組各時間段抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).(3)Western-blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組24h、48h、72h survivin蛋白相對空白對照組表達(dá)量分別為0.74±0.01、0.35±0.02、0.34±0.01,陰性對照組分別為0.99±0.02、1.00±0.02、0.99±01,轉(zhuǎn)染組與陰性或空白對照組相比明顯降低(P＜0.01).轉(zhuǎn)染組24h與48h或72h結(jié)果相比存在顯

11、著性差異(P<0.01),48h與72h結(jié)果相比無顯著性差異(P<0.05).(4)TUNEL結(jié)果:轉(zhuǎn)染48h后,轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組細(xì)胞凋亡率分別為31.0﹪、3.33﹪、3.67﹪,轉(zhuǎn)染組明顯高于陰性或空白對照組(P<0.01).結(jié)論:(1) survivin特異性shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功.(2) 轉(zhuǎn)染survivin特異性shRNA真核表達(dá)載體后,可以使HL-60細(xì)胞生長和增殖受到抑制.(3) 利用RNA干擾沉默S