IL-31真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)HaCaT細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:
　　(1)克隆人白細(xì)胞介素-31(hIL-31)cDNA序列,構(gòu)建pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表達(dá)載體。
　　(2)將構(gòu)建成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,篩選出穩(wěn)定表達(dá)hIL-31的細(xì)胞株,分離并純化hIL-31蛋白。
　　(3)使用不同濃度的hIL-31作用于HaCaT細(xì)胞,探討其對(duì)IL-6、TNF-αmRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)的影響。

2、>　　(4)使用不同濃度的hIL-31作用于HaCaT細(xì)胞,探討其對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的影響。
　　方法:
　　(1)采用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得人外周血單核細(xì)胞,培養(yǎng)之后加入終濃度為20nmol/L的PMA,繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。
　　(2)Tizol法提取細(xì)胞總RNA,RT-PCR擴(kuò)增hIL-31cDNA序列,并將其構(gòu)建到真核表達(dá)載體pSecTag2/Hygro B上。
　　(3)使用DNA轉(zhuǎn)染試劑盒將構(gòu)建

3、成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞當(dāng)中,并使用潮霉素進(jìn)行篩選,獲得單個(gè)克隆后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),采用核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離與純化。
　　(4)使用不同濃度的hIL-31干預(yù)HaCaT細(xì)胞,采用Real-Time PCR的方法分析其對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)的影響;ELISA法檢測(cè)其對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)的影響;MTT法分析其對(duì)細(xì)胞增殖的影響以及流式細(xì)

4、胞儀檢測(cè)對(duì)細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測(cè)序分析鑒定,成功獲得hIL-31基因cDNA全長(zhǎng)序列和pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表達(dá)載體。
　　(2)成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)hIL-31的COS-7細(xì)胞株,并分離純化出IL-31蛋白。
　　(3)hIL-31能夠顯著誘導(dǎo)IL-6、TNF-αmRNA和蛋白水平的表達(dá),并具有時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)。
　　(4)小劑量、短時(shí)間

5、的hIL-31抑制HaCaT細(xì)胞增殖的作用不明顯;高劑量、長(zhǎng)時(shí)間的hIL-31對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用。
　　(5)hIL-31可以改變HaCaT細(xì)胞周期,使得G1期細(xì)胞數(shù)量增加,S期和G2期細(xì)胞數(shù)量減少。
　　結(jié)論:
　　(1)IL-31可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞IL-6和TNF-αmRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　(2)外源性的IL-31可以改變HaCaT的細(xì)胞周期,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖,并且其效應(yīng)具有時(shí)