小鼠ACE2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:本研究擬構(gòu)建小鼠ACE2基因的真核表達(dá)載體，并觀察ACE2基因轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)后對(duì)AngII促VSMC異常增殖效應(yīng)的影響，初步探討產(chǎn)生該影響的可能機(jī)制。 方法:1.通過(guò)RT-PCR從小鼠腎臟擴(kuò)增出小鼠ACE2基因全長(zhǎng)cDNA，并通過(guò)酶切連接、轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)方法將其連接到載體pcDNA3.1/Hygro(+)上，從而構(gòu)建小鼠ACE2基因的真核表達(dá)載體pm-ACE2，并通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定。2.通過(guò)脂質(zhì)體法將

2、所構(gòu)建的pm-ACE2轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，48小時(shí)后收集蛋白，經(jīng)過(guò)Western-Blot來(lái)驗(yàn)證該pm-ACE2的表達(dá)功能。3.用脂質(zhì)體法將pm-ACE2轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈VSMC后給予AngII(終濃度10-7mol/L)處理，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞組、AngII組和空載體pcDNA3.1/Hygro(+)轉(zhuǎn)染+AngII組作為對(duì)照，通過(guò)CCK8和檢測(cè)各組細(xì)胞周期兩項(xiàng)指標(biāo)來(lái)觀察ACE2基因轉(zhuǎn)染對(duì)Ang II促VSMC增殖效應(yīng)的影響，初

3、步探討ACE2發(fā)揮上述作用的機(jī)制。 結(jié)果:1.通過(guò)測(cè)序證實(shí)成功克隆小鼠ACE2基因全長(zhǎng)cDNA并將其連接至載體pcDNA3.1/Hygro(+)上，測(cè)序結(jié)果提示存在3處同義突變；2.所構(gòu)建的pm-ACE2在真核細(xì)胞中具有表達(dá)功能；3.AngII組OD值較正常細(xì)胞組明顯增高(P<0.05)，pmACE2+AngII組與AngII組相比OD值顯著降低(P<0.05)；4.與正常細(xì)胞組相比，AngII組處于G0/G1期VSMC的百分率