高糖對大鼠血管平滑肌細胞OPG、RANKL表達的影響.pdf

1、目的:研究高糖對大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(VSMCs)骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)及核因子-κB受體活化因子配體(Receptoractivator of NF-κB ligand，RANKL)表達的影響。
　　方法:1、動物實驗:清潔級SD大鼠20只，隨機分為對照組及實驗組（糖模型組），每組各10只。經(jīng)合理喂養(yǎng)1周。滿足飲食正常、體重(200-250g)及血糖(3-5mmol/l)條件的大鼠用于制造Ⅰ型糖

2、尿病模型。對照組經(jīng)腹腔注射生理鹽水(55mg/kg);實驗組經(jīng)腹腔注射鏈尿佐菌素溶液(55mg/kg)。注射藥物1周后大鼠空腹血糖濃度＞16.7mmol/l，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦癥狀者為Ⅰ型糖尿病模型。頸椎脫位法處死大鼠，獲取大鼠胸主動脈中膜組織（主要由平滑肌細胞組成），經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯溶液透明、石蠟滲透包埋制成蠟塊，切片機切割獲取病理切片，應用免疫組化法鑒定對照組及實驗組大鼠主動脈中膜組織OPG及RANKL的表達情況。2

3、、細胞實驗:(1)滲透壓排除試驗:分別應用低糖（5.5mmol/l）、甘露醇（25mmol/l）、高糖(25mmol/l)三種不同的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠胸大動脈平滑肌細胞(A7R5)，應用免疫共沉淀法(Western Blot)檢測OPG、RANKL蛋白的表達，應用實時熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測OPG mRNA及RANKL mRNA的表達。(2)時間梯度試驗:固定培養(yǎng)基（糖濃度:25mmol/l）培養(yǎng)A7R5細胞，分0h、4h

4、、8h、12h、24h、48h六個時間點采集細胞并提取蛋白及RNA，應用Western Blot及qRT-PCR法分別檢測OPG、RANKL蛋白及mRNA表達情況。(3)濃度梯度試驗:分別應用含5.5mmol/l、12.5mmol/l、25mmol/l、50mmol/l四種不同糖濃度的培養(yǎng)基培育A7R5細胞，培育滿48小時后收集細胞，提取蛋白及RNA，應用應用Western Blot及qRT-PCR法分別檢測OPG、RANKL蛋白及mR

5、NA表達情況。
　　結(jié)果:(1)動物實驗:A:動物模型結(jié)果:對照組大鼠體重隨喂養(yǎng)時間延長逐漸增加，且未完全出現(xiàn)或不出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，空腹血糖水平＜16.7mmol/l;實驗組大鼠在適應性喂養(yǎng)1周后體重有增加，但在注射STZ后1周開始逐漸出現(xiàn)了兩種變化:a:4只大鼠體重不減輕，但增長幅度較正常大鼠減弱，未出現(xiàn)明確的多飲、多食及多尿癥狀，空腹血糖水平范圍（5-16.7mmol/l）或(3-5mmol/l)。b:6只大鼠體重在注

6、射STZ后逐漸減輕，且相繼出現(xiàn)多飲、多食及多尿癥狀，空腹血糖＞16.7mmol/l。B:免疫組化結(jié)果:Ⅰ型糖尿病模型大鼠胸主動脈中膜組織OPG表達較正常大鼠增多，病理切片顯示免疫復合沉淀熒光密度較正常大鼠增強。而RANKL表達較正常大鼠下降，病理切片顯示免疫復合沉淀熒光密度較正常大鼠減低。(2)細胞實驗:A:滲透壓試驗:高糖組A7R5細胞OPG蛋白及mRNA的表達較低糖組升高(P＜0.05)，而RANKL蛋白及mRNA的表達較低糖組下降

7、(P＜0.05);甘露醇組A7R5細胞OPG蛋白及mRNA的表達較低糖組無明顯改變，對比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，RANKL蛋白及mRNA的表達較低糖組無明顯改變，統(tǒng)計無顯著差異(P＞0.05)。B:時間梯度試驗:在一定糖濃度（25mmol/l）刺激下，胸主動脈平滑肌細胞OPG蛋白及mRNA的表達均隨著培育時間的延長逐漸升高，且各時間點的蛋白和mRNA表達水平兩兩對比統(tǒng)計皆具有顯著差異(P＜0.05);而RANKL蛋白及mRNA表達

8、隨時間延長逐漸降低，各時間點蛋白及mRNA表達水平兩兩對比統(tǒng)計皆具有顯著差異(P＜0.05)。C:濃度梯度試驗:在一定的作用時間內(nèi)(48h)，隨著培養(yǎng)基含糖濃度的不斷增加，OPG蛋白及mRNA的表達呈上升趨勢，且5.5mmol/l、12.5mmol/l及25mmol/l三組兩兩對比皆存在顯著差異(P＜0.05)，但25mmol/l與50mmol/l組對比上述蛋白及mRNA表達無顯著差異(P＞0.05)。RANKL蛋白及mRNA表達水平隨