Caveolae對血管平滑肌細(xì)胞CLR膜分布的影響.pdf

1、目的：已經(jīng)證實細(xì)胞膜小凹結(jié)構(gòu)（Caveolae）是許多信號分子、激酶以及多數(shù)受體在細(xì)胞膜的聚集區(qū)。降鈣素受體樣受體（CLR）是降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）受體的主要成分蛋白，其在膜上分布的多少決定了CGRP對細(xì)胞的作用強(qiáng)弱。本研究旨在探索CLR膜分布的變化是否與Caveolae有關(guān)聯(lián)，并進(jìn)一步探索Caveolae的標(biāo)記蛋白Caveolin-1與CLR是否存在相互作用。
　　方法：用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)鼠源性的血管平滑

2、肌細(xì)胞株A10，0.1%FBS的培養(yǎng)基同步化細(xì)胞24h，用CGRP，β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin,β-CD）等因素按實驗分組處理；RT-PCR法檢測CLR mRNA的含量；蛋白印跡法檢測CLR蛋白水平；免疫共沉淀法檢測CLR和caveolin-1的相互作用；免疫熒光法、激光共聚焦法檢測CLR和caveolin-1的亞細(xì)胞共定位情況。
　　結(jié)果：①CGRP能時間依賴性地減少CLR在血管平滑肌細(xì)胞A10細(xì)胞膜上的分布，在4

3、小時左右降低幅度最大，之后細(xì)胞膜上CLR蛋白水平變化不大，進(jìn)入平臺期，而CGRP受體拮抗劑CGRP8-37能阻斷CGRP的此效應(yīng)。②β-CD，一種能破壞細(xì)胞膜上小凹結(jié)構(gòu)的試劑，能拮抗CGRP刺激引起的細(xì)胞膜上CLR的減少。值得關(guān)注的是，β-CD處理組細(xì)胞后，CLR總蛋白、CLR mRNA表達(dá)沒有明顯的差別(P>0.05)，所以CLR蛋白的膜/漿比值減低，因此我們推測小凹結(jié)構(gòu)的完整性可能對CLR應(yīng)答CGRP的效應(yīng)起著重要的作用。③免疫共沉