藏紅花素對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：本研究探討藏紅花素(crocin)對(duì)人急性白血病細(xì)胞HL-60增殖抑制的影響及其促凋亡機(jī)制。
　　 方法：無(wú)菌條件下配制crocin溶液，實(shí)驗(yàn)分為A-F六組，crocin終濃度分別為0、0.625、1.25、2.5、5.0和10mg/ml。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板人工計(jì)數(shù)法測(cè)定HL-60細(xì)胞在不同濃度crocin作用后的生長(zhǎng)曲線，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)混合染液染色，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡

2、細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，計(jì)算不同濃度crocin作用于HL-60細(xì)胞不同時(shí)間的抑制率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)crocin作用48h后HL-60細(xì)胞周期分布，RT-PCR檢測(cè)crocin作用24、48h后bcl-2,bax基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 ①細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)Crocin濃度為0.625-10mg/ml，體外可抑制HL-60細(xì)胞的增殖，隨著藥物濃度的升高，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HL-60

3、細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，呈現(xiàn)出抑制作用，以10mg/ml濃度作用48h時(shí)抑制作用最明顯。MTT法結(jié)果顯示，crocin作用24h時(shí)，隨著藥物濃度的升高，抑制率逐漸升高，組間比較差異有顯著性(F=2.84，P<0.05)，以10mg/ml濃度時(shí)抑制率最高。crocin作用48h時(shí)，隨著藥物濃度的升高，實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞抑制率逐漸升高，組間比較差異有顯著性(F=4.71，P<0.05)。當(dāng)crocin濃度為10mg/ml時(shí)，作用48h與24h時(shí)相比，差

4、異有顯著性(t=3.59，P<0.05)。
　　 ②熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞觀察結(jié)果顯示，crocin作用24h后，對(duì)照組中偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞，在0.625-5mg/ml時(shí)，隨著藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多，以5mg/ml濃度凋亡細(xì)胞形態(tài)最為明顯．10mg/ml濃度組，凋亡細(xì)胞少見(jiàn)，可見(jiàn)大量壞死及崩解的細(xì)胞。作用48h時(shí)，以5mg/ml濃度組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多，且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，晚期凋亡細(xì)胞增多。在0.625-5mg/ml范圍內(nèi)

5、，HL-60細(xì)胞凋亡率逐漸升高，濃度為10mg/ml時(shí)凋亡率反而下降，藥物濃度過(guò)高表現(xiàn)出壞死作用。
　　 ③流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，crocin作用于HL-60細(xì)胞48h后，在0-5mg/ml濃度范圍內(nèi)，G0/G1期細(xì)胞數(shù)比例組間比例差異有顯著(F=185，P<0.05)，組內(nèi)兩兩比較差異仍有顯著性(P<0.05)。在0.625-5mg/ml藥物范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的升高，G0/G1期細(xì)胞數(shù)比例逐漸升高，以濃度為5mg/

6、ml時(shí)G0/G1期細(xì)胞數(shù)比例最高，與實(shí)驗(yàn)各組比較差異有顯著性（P均<0.01）。濃度為10mg/ml時(shí)，G0/G1期細(xì)胞數(shù)比例反而下降，與濃度為5mg/ml時(shí)比較差異有顯著性(P<0.05)，與A-D各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）
　　 ④RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，作用時(shí)間分別為24h、48h時(shí)，隨crocin作用濃度的升高，bcp-2基因條帶亮度逐漸減弱。灰度掃描比值結(jié)果顯示：在0-10mg/ml藥物范圍內(nèi)，組間比

7、較差異有顯著性(P<0.05)，組內(nèi)兩兩比較，A組與B組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨藥物濃度升高，bcl-2基因表達(dá)逐漸減少，以10mg/ml表達(dá)最弱。
　　 作用時(shí)間分別為24h、48h時(shí)，隨crocin作用濃度的升高，bax基因條帶亮度逐漸增強(qiáng)?；叶葤呙璞戎到Y(jié)果顯示：在0-10mg/ml藥物范圍內(nèi)，組間比較差異有顯著性(P<0.05)，組內(nèi)兩兩比較，A組與B組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨藥物濃度升高，bax基

8、因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，以10mg/ml表達(dá)最強(qiáng)．
　　 結(jié)論：
　　 1、通過(guò)不同濃度crocin作用，HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制，并呈現(xiàn)出劑量時(shí)間依賴關(guān)系。在0.625-5mg/ml范圍內(nèi)，HL-60細(xì)胞凋亡率逐漸升高。當(dāng)crocin濃度10mg/ml時(shí)，HL-60細(xì)胞凋亡率并沒(méi)有升高，反而下降，表現(xiàn)為細(xì)胞壞死。
　　 2、Crocin對(duì)HL-60細(xì)胞周期起阻滯作用，被阻滯于G0/G1，且在5mg/ml時(shí)阻滯作用最

9、明顯。濃度為10mg/ml時(shí)，G0/G1期細(xì)胞數(shù)比例反而下降，藥物濃度過(guò)高時(shí)，對(duì)HL-60細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞毒性作用。
　　 3．Crocin抑制Bcl-2基因表達(dá)，在1.25-10mg/ml范圍內(nèi)均表現(xiàn)出抑制作用，在濃度為10mg/ml作用-48h時(shí)抑制作用最強(qiáng)。Crocin促進(jìn)Bax基因的表達(dá)，在1.25-10mg/ml范圍內(nèi)均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，在濃度為10mg/ml作用48h時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)。
　　 4、Crocin可