泥蚶提取物海生素對Hl-60細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)分化的影響.pdf

1、急性白血病(AL)是一種獲得性造血干細(xì)胞異常造成的惡性增殖性疾病，近年來有人提出了腫瘤的誘導(dǎo)分化治療。但是迫切需要尋找新的毒性小、選擇性強(qiáng)的誘導(dǎo)分化劑來滿足臨床需要。
　　海洋中藥是中藥的重要組成部分，海生素(HSS)是近年來應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)從海洋生物泥蚶軟體中提取出的一種小分子糖多肽類物質(zhì)，體外試驗(yàn)證實(shí)對腎癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞有明顯的抑制增殖作用。
　　本研究以HL-60細(xì)胞為體外分化誘導(dǎo)模型，觀察HSS對HL-60細(xì)胞增殖

2、及分化成熟的影響，并與最常用的誘導(dǎo)分化劑ATRA和AS2O3的作用進(jìn)行比較，并初步探討了其作用機(jī)制，以其希望尋找一種新的誘導(dǎo)分化和凋亡劑。
　　目的:
　　1.研究HSS對HL-60細(xì)胞的增殖的影響。
　　2.研究HSS對HL-60細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)分化的作用，并探討其臨床應(yīng)用價值。
　　3.闡明HSS對HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化及凋亡作用可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1.研究HSS對HL-60細(xì)胞的增殖的影

3、響。
　　2.研究HSS對HL-60細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)分化的作用，并同臨床最常用的誘導(dǎo)分化劑ATRA、AS2O3在細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)、表面分化抗原、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分布等方面進(jìn)行比較，探討其臨床應(yīng)用價值。
　　3.HSS對HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化及凋亡作用可能的機(jī)制
　　結(jié)果:
　　1.HSS對HL-60細(xì)胞增殖的影響
　　HSS(0.1mg/L，1mg/L，10mg/L)12h、24h、48h、72h各時間點(diǎn)

4、吸光度值與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;HSS(100mg/L，1000 mg/L)12h吸光度值與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），24h、48h、72h各時間點(diǎn)吸光度值與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與0.1、1、10 mg/L組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);在100、1000 mg/L濃度下12h、24h、48h、72h各個時間點(diǎn)之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。經(jīng)Graphpad Prism5

5、軟件分析72小時HSS作用HL-60細(xì)胞的IC50為:40mg/L。
　　2.HSS對HL-60細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)分化的作用及同ATRA、AS2O3的作用進(jìn)行比較
　　2.1 對HL-60細(xì)胞增殖的影響:HSS100mg/L、ATRA5umol/L、AS2O35umol/L均對HL-60細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用并呈時間效應(yīng)關(guān)系。HSS組24小時、48小時、72小時增殖抑制率分別為25.23±5.13％、39.13±3.14％、7

6、0.45±8.20％;ATRA組分別為:4.56±3.31％23.20±4.32％、44.22±6.26％; AS2O3組分別為:4.25±3.82％、36.80±2.45％、73.62±7.28％。24小時時HSS組的增殖抑制率高于ATRA組、AS2O3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。48小時、72小時時高于ATRA組(P＜0.05)，與AS2O3組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2.2 光鏡下細(xì)胞形態(tài)變化:對照組

7、HL-60細(xì)胞體積大，大多為圓形或不規(guī)則橢圓形，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰可見，染色質(zhì)分散，胞漿嗜堿深染，細(xì)胞核和細(xì)胞漿比例增大;ATRA組HL-60細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞核凹陷縮小，并轉(zhuǎn)變?yōu)闂U狀核、腎形核甚至出現(xiàn)分葉核。核仁數(shù)量減少，染色質(zhì)致密變粗。細(xì)胞核和細(xì)胞漿比例縮小，部分細(xì)胞發(fā)生凋亡;AS2O3組HL-60細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核凹陷縮小，部分細(xì)胞核斷裂成數(shù)個大小不等的圓形顆粒，染色質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)，部分細(xì)胞形成凋亡小體。HSS組HL-60

8、細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞核縮小內(nèi)陷，核仁數(shù)量減少，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，出現(xiàn)了多葉核等，細(xì)胞漿增多，核漿比例縮小，染色質(zhì)變粗致密。
　　2.3 細(xì)胞表面分化抗原的變化:HSS100mg/L、ATRA5umol/L、AS2O35umol/L作用HL-60細(xì)胞72小時后，細(xì)胞表面CD11b陽性率分別為63.50±8.28％、70.65±7.20％、18.30±2.27％，對照組為6.42±4.04％，各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異均

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); HSS組與ATRA組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，與AS2O3組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。CD15在HSS組、ATRA組、AS2O3組和對照組分別為93.24±8.06％、93.58±6.28％、91.28±7.27％、96.50±7.24％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.4 細(xì)胞凋亡率的變化:HSS100mg/L，ATRA5umol/L，AS2O35umol/L作用HL-60細(xì)胞72小時

10、后，凋亡率分別為:38.90±3.24％、40.34±4.25％、38.18±7.20％，對照組為5.10±4.20％。各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。HSS組與ATRA、AS2O3組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2.5 細(xì)胞周期分布:經(jīng)HSS100mg/L作用HL-60細(xì)胞72小時后G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例分別為:67.8±5.2％、26.5±3.8％5.7±2.0％，對照組為40.

11、1±4.0％、50.2±1.4％、9.7±2.6％。HSS組大部分細(xì)胞停留在G0/G1期，S期細(xì)胞明顯減少，G2/M期細(xì)胞相對減少。HSS組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ATRA組分別為:76.0±3.9％、18.7±2.3％、5.3±1.2％，As2O3組分別為72.9±2.7％、20.1±1.9％、7.0±1.5％;100mg/LHSS組與5μM ATRA組比較，G0/G1期細(xì)胞所占比例低(P＜0.05)，與5μM

12、AS2.O3組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.HSS對HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化及凋亡作用可能的機(jī)制
　　3.1 經(jīng)HSS100mg/L作用HL-60細(xì)胞72小時后，HSS組HL-60細(xì)胞bcl-2基因mRNA相對表達(dá)量為0.68±0.06，對照組為0.89±0.12，HSS組bcl-2基因表達(dá)減弱，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;AS2O3組、ATRA組bcl-2基因表達(dá)也減弱，分別為0.81±0.1

13、6和0.73±0.29，但與對照組比較差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，HSS組同AS2O3組、ATRA組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;HSS組、AS2O3組、ATRA組bax基因mRNA相對表達(dá)量分別為:0.89±0.15,0.50±0.05，0.89±0.06，對照組為0.18±0.07;各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HSS組同ATRA組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但同AS2O3組比

14、較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，要高于AS2O3組。
　　3.2 HSS組、AS2O3組、ATRA組mpo基因mRNA相對表達(dá)量分別為:0.44±0.14、0.86±0.08、0.83±0.15，對照組為0.95±0.17;各實(shí)驗(yàn)組mpo基因表達(dá)減弱，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。最明顯的是HSS組，其次為ATRA組和AS2O3組;HSS組與ATRA組、AS2O3組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

15、
　　3.3 Western blotting結(jié)果顯示，HSS組、ATRA組、AS2O3組bcl-2蛋白表達(dá)量分別為:0.45±0.09、0.36±0.11、0.39±0.15，對照組為0.76±0.08，各實(shí)驗(yàn)組bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于對照組(P＜0.05)。HSS組、ATRA組、AS2O3組bax蛋白表達(dá)量分別為:0.70±0.12、0.74±0.10、0.69±0.09，對照組為0.35±0.10，各實(shí)驗(yàn)組bax蛋白表達(dá)顯

16、著高于對照組（P＜0.05）。bcl-2蛋白和bax蛋白表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　結(jié)論:
　　1.低濃度HSS對HL-60細(xì)胞無增殖抑制作用;較高濃度HSS24小時后對HL-60細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用并呈時間、劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　2.HSS對HL-60細(xì)胞還有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化的作用。其誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡及分化的能力在某些方面同ATRA、AS2O3類似，甚至優(yōu)于ATRA、AS