XIAP siRNA增加HL-60細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性的研究.pdf

1、目的：利用RNA干擾技術(shù)抑制XIAP在人白血病細(xì)胞HL-60中的表達(dá)，觀察siRNA干擾后HL-60細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素處理的敏感性。 方法： 1.根據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)原則, 運(yùn)用生物信息學(xué)設(shè)計(jì)出XIAP 4個(gè)位點(diǎn)的干擾序列，運(yùn)用PCR產(chǎn)生siRNA表達(dá)框架(siRNA expression cassettes，SECs),然后分別轉(zhuǎn)染指數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞, 用實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)XIAP mRNA，篩選出抑

2、制效率較高的siRNA序列。將篩選出的siRNA序列插入siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒psilencircle中，構(gòu)建psilecircle-XIAPsi，并構(gòu)建相應(yīng)的siRNA亂序?qū)φ毡磉_(dá)質(zhì)粒psilecircle-XIAPsc。 2. Psilecircle-XIAPsi，psilecircle-XIAPsc分別轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，挑選穩(wěn)定表達(dá)psilecircle-XIAPsi的細(xì)胞克隆，實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)XIAP的mRNA水

3、平的變化，Western blot檢測(cè)XIAP蛋白水平的變化。用MTT法檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)此載體的腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性的變化, Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙色熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：在待選的四個(gè)siRNA干擾位點(diǎn)中，位點(diǎn)（94-112）抑制效率最高，可達(dá)到83.1％。構(gòu)建psilecircle-XIAPsi，psilecircle-XIAPsc，StuⅠ酶切電泳，可見(jiàn)4800bp左右的條帶，DAN測(cè)序結(jié)果

4、與設(shè)計(jì)序列一致，表明psilecircle-XIAPsi，psilecircle-XIAPsc真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。Psilecircle-XIAPsi轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞表達(dá)后，實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)XIAP mRNA、Western blot檢測(cè)XIAP蛋白，與未轉(zhuǎn)染組相比明顯抑制了XIAP蛋白的表達(dá)；MTT檢測(cè)細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，與未轉(zhuǎn)染組相比敏感性增加了4倍；用阿霉素作用48h后，Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙色熒光標(biāo)記，