替莫唑胺衍生物治療人腦膠質(zhì)瘤的實驗研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的腫瘤，目前國內(nèi)外針對惡性膠質(zhì)瘤的治療原則是強調(diào)以手術(shù)切除腫瘤為主，術(shù)后給予放療、化療等綜合治療，但療效并不滿意。膠質(zhì)瘤化療近幾年取得了一些新的進展，其中替莫唑胺（Temozolomide，簡稱TMZ）是一種治療腦膠質(zhì)瘤的新約，因其較寬的抗腫瘤譜、服用方法簡便、易于透過血腦屏障、與其他藥物沒有疊加毒性、可用于對亞硝基脲耐藥的患者，而引起廣泛關(guān)注。
　　 TMZ應(yīng)用臨床以來，與既往的化療藥物相比取

2、得了一定的生存受益，降低了藥物的毒副反應(yīng)，口服給藥方法簡單，患者易于接受，但其胃腸道反應(yīng)明顯，雖然臨床上常規(guī)輔助以止吐藥物對癥應(yīng)用，但仍然不便應(yīng)用于合并有消化道疾病的腦膠質(zhì)瘤患者，有鑒于此，相關(guān)學者針對抗癌新藥替莫唑胺的作用特點和理化性質(zhì)，以替莫唑胺及其活性代謝物3-甲基-4-氧代咪唑[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羧酸(TMZA)為先導(dǎo)化合物，設(shè)計合成了2.替莫唑胺-8-羧酸聚乙二醇酯(2T-P400、2T-P600)兩個替

3、莫唑胺水溶性衍生物，然后我們通過體外及體內(nèi)的實驗觀察其對SHG-44人腦膠質(zhì)瘤細胞及組織的抑制效應(yīng)。
　　 第一部分，替莫唑胺衍生物2-替莫唑胺-8-羧酸聚乙二醇酯(2T-P400、2T-P600)對膠質(zhì)瘤細胞系SHG-44體外抑瘤效應(yīng)的觀察
　　 目的:觀察替莫唑胺衍生物(2T-P400、2T-P600)在體外對SHG-44人腦膠質(zhì)瘤細胞系的抑制效應(yīng)。
　　 方法:將人腦膠質(zhì)瘤細胞系SHG-44復(fù)蘇后接種于含1

4、0％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，傳代5-6次后，取生長狀態(tài)良好的腫瘤細胞，以0.25%的胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)液稀釋至濃度為1x104個/ml，稀釋后以100μl/孔接種于96孔板，待細胞生長24小時后，設(shè)2T-P400組、2T-P600組、TMZ組、PEG400組、PEG600組和空白對照組六組，每一藥物組又分為5個濃度梯度進行，其中TMZ、PEG400、PEG600的終濃度為200umol/L、100umol/L、50umol/L、

5、25umol/L、10umol;2T-P400、2T-P600終濃度為100umol/L、50umol/L、25umol/L、12.5umol/L、5umol/L，空白對照組中放入等量的DMEM培養(yǎng)液，然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。加藥96小時后采用MTT法測定每孔在570nm處的OD值，計算其IC50值。比較各藥物組相對于空白對照組（僅加入DMEM培養(yǎng)基）對SHG44膠質(zhì)瘤細胞的抑制率。
　　 結(jié)果:實驗結(jié)果顯示:隨著藥物濃度的增

6、加，2T-P400、2T-P600及TMZ對腫瘤細胞的抑制率逐漸升高;2T-P400、2T-P600對SHG-44膠質(zhì)瘤細胞的殺傷作用與TMZ相近，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），三者相比陰性對照組PEG400、PEG600及空白對照組對膠質(zhì)瘤細胞抑制作用顯著(P＜0.01)。PEG400、PEG600對膠質(zhì)瘤細胞抑制作用相對于空白對照組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。其中TMZ的IC50值為9.73±0.24ug/ml，兩種替莫唑胺衍生物

7、2T-P400、2T-P600的IC50值分別為12.9±0.34ug/ml，15.7±0.36ug/ml，兩種陰性對照組PEG400、PEG600的IC50值分別為150.8±3.36ug/ml、171.6±4.11ug/ml。
　　 結(jié)論:體外實驗證實了2T-P400、2T-P600保留了TMZ的抑瘤活性，其水溶性特征，為膠質(zhì)瘤患者在術(shù)后TMZ類藥物化療上提供了新的藥物及用藥途徑選擇。
　　 第二部分，替莫唑胺衍生物

8、2-替莫唑胺-8-羧酸聚乙二醇酯(2T-P400、2T-P600)治療人腦膠質(zhì)瘤皮下移植瘤的實驗研究
　　 目的:觀察替莫唑胺衍生物(2T-P400、2T-P600)對SHG-44人腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤的抑瘤效應(yīng)。
　　 方法:將約1×107個SHG-44膠質(zhì)瘤細胞接種于BALB/C-nu裸小鼠右腋皮下，致瘤后無菌條件下取出并以組織塊移植傳代,4代后生物學特征穩(wěn)定（致瘤率100%，生長速度差異很?。?，將皮下移植瘤以無菌

9、技術(shù)取出，剪切后按2mm3/鼠用套管針接種于裸鼠右腋皮下，待腫瘤生長至體積約100mm3時，將荷瘤鼠隨機分為5組:2T-P400組、2T-P600組、TMZ組及PEG組及NS組，每組10只。其中TMZ組為陽性對照組，PEG組為陰性對照組，NS組為空白對照組。各組用藥劑量和用藥方法分別為TMZ50mg/kg/天，連續(xù)灌胃給藥5天，2T-P400組、2T-P600組給藥劑量分別為98mg/kg、123mg/kg（其TMZ含量同TMZ組），連

10、續(xù)尾靜脈給藥5天，PEG組給藥劑量為103mg/kg（劑量同2T-P400組PEG含量），連續(xù)尾靜脈給藥5天，NS組為空白對照組，給藥劑量為0.2ml/鼠，連續(xù)尾靜脈給藥5天。治療開始后每4天測量一次實驗鼠體重及腫瘤短徑a和長徑b，腫瘤體積的計算公式為V=a2×b/2。一個TMZ治療周期28天后行末次測量，然后根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算相對腫瘤增殖率。
　　 結(jié)果:試驗結(jié)果顯示:2T-P400、2T-P600和TMZ三組間皮下腫瘤增殖率無

11、統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，均明顯低于PEG組和NS組(P＜0.01)。PEG組和NS組增殖率無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:本實驗證實2T-P400、2T-P600靜脈用藥對皮下移植瘤抑制作用與等量TMZ口服抑制作用相近，保留了TMZ的抑瘤活性。2T-P400、2T-P600在水性介質(zhì)中的高溶解度和穩(wěn)定性使避開胃腸道反應(yīng)，提高用藥劑量，保持穩(wěn)定血藥濃度成為可能。
　　 第三部分，替莫唑胺衍生物2-瞀莫唑胺-

12、8-羧酸聚乙二醇酯(2T-P400、2T-P600)治療人腦膠質(zhì)瘤顱內(nèi)原位移植瘤的實驗研究
　　 目的:建立人腦膠質(zhì)瘤裸小鼠顱內(nèi)原位移植腫瘤模型，并觀察在此模型中替莫唑胺衍生物(2T-P400、2T-P600)對膠質(zhì)瘤生長的抑制效應(yīng)。
　　 方法:將1.0mm3SHG-44皮下移植瘤組織塊植入裸小鼠右側(cè)尾狀核，于接種后0d、5d、10d、15d、20d、25d處死荷瘤鼠（每次3只），解剖取全腦及時放入10%福爾馬林固定液

13、中固定24小時，石蠟包埋后切片，HE染色后測量腫瘤最大層面最短徑(a)和最長徑(b)，根據(jù)公式計算腫瘤體積V=a2×b/2，繪制腫瘤生長曲線。同樣方法制作藥物試驗用裸小鼠腦內(nèi)移植瘤模型，接種后10天將動物隨機分為5組，設(shè)2T-P400組、2T-P600組、TMZ組、PEG組及NS組，每組10只鼠。其中TMZ組為陽性對照組，PEG組為陰性對照組，NS組為空白對照組。各組用藥劑量和用藥方法分別為TMZ50mg/kg/天，連續(xù)灌胃給藥5天，2

14、T-P400組、2T-P600組給藥劑量分別為98mg/kg、123mg/kg（其中TMZ含量同TMZ組），連續(xù)尾靜脈給藥5天，PEG組給藥劑量為103mg/kg（劑量同2T-P400組PEG含量），連續(xù)尾靜脈給藥5天。NS組為空白對照組，給藥劑量為0.2ml/鼠，連續(xù)尾靜脈給藥5天。治療28天后處死小鼠，解剖取全腦后及時放入10%福爾馬林固定液中固定24小時，石蠟包埋后切片、HE染色、測量計算顱內(nèi)腫瘤體積。
　　 結(jié)果:實驗證