GM-CSF對替莫唑胺抗高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用.pdf

1、研究背景：高級別膠質(zhì)瘤是成人最常見的原發(fā)性腦惡性腫瘤，占腦腫瘤的60-70％，目前的標(biāo)準(zhǔn)治療為最大化手術(shù)切除腫瘤后行放化療，替莫唑胺是目前被廣泛接受治療腦膠質(zhì)瘤的化療藥物，主要通過DNA鳥嘌呤的O6和N2位點(diǎn)上的烷基化（甲基化）發(fā)揮細(xì)胞毒作用，腫瘤耐藥現(xiàn)象仍是目前治療高級別膠質(zhì)瘤的難題之一。與此同時，與放化療相關(guān)的血液系統(tǒng)毒副作用已引起重視，主要表現(xiàn)為骨髓增生異常綜合征、白血病以及嚴(yán)重骨髓抑制，粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granuloc

2、yte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）是造血生長因子家族的成員之一,常被用來治療惡性腫瘤患者化療所致的的白細(xì)胞的數(shù)量和/或功能減退，然而應(yīng)用GM-CSF對腦膠質(zhì)瘤患者化療的影響如何仍不可知。
　　研究目的：擬應(yīng)用GM-CSF對高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，從而研究TMZ對GM-CSF干預(yù)后的高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷性并探索其可能的機(jī)制。
　　材料與方法：
　　1.高級

3、別膠質(zhì)瘤患者資料收集2013年9至2015年8月收集在河南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科三病區(qū)接受手術(shù)治療的原發(fā)性高級別腦膠質(zhì)瘤患者41例，腫瘤組織均行常規(guī)病理檢查、免疫組化檢測MGMT表達(dá)、MGMT啟動子甲基化并進(jìn)行膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，患者及家屬均簽署知情同意書。
　　2.高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的選取和GM-CSFR的檢測根據(jù)病理結(jié)果、MGMT表達(dá)水平、基因啟動子甲基化狀態(tài)以及細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果，選6例高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞融合度達(dá)90%時進(jìn)行傳

4、代，傳至第3-4代細(xì)胞穩(wěn)定后采用免疫熒光法檢測GM-CSFR在細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.時間-細(xì)胞存活率分析設(shè)置TMZ組、TMZ+GM-CSF組和調(diào)零組（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），GM-CSF和TMZ終濃度分別為50ng/ml和100μmol/L。培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后分別檢測細(xì)胞的存活率，篩選出最佳的培養(yǎng)時間。
　　4.MTT法檢測細(xì)胞活性設(shè)置對照組、TMZ組、GM-CSF組、TMZ+GM-CSF組、調(diào)零組

5、（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），先加入GM-CSF進(jìn)行干預(yù)，12h后加入TMZ使其終濃度分別為50ng/ml和100μmol/L，72h后檢測各組的細(xì)胞存活率。
　　5.流式檢測細(xì)胞周期設(shè)置對照組、GM-CSF組，細(xì)胞傳代6h后加入GM-CSF使其終濃度為50ng/ml，48h后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。
　　6.流式檢測細(xì)胞凋亡率設(shè)置對照組、GM-CSF組、TMZ組、GM-CSF聯(lián)合TMZ組，加入GM-CSF12h

6、后添加TMZ，72h后收集細(xì)胞用凋亡試劑盒處理上機(jī)檢測。
　　結(jié)果：
　　1.高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)選取選取的6例細(xì)胞中間變性星形細(xì)胞瘤2例，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤4例；MGMT蛋白表達(dá)陰性3例，陽性表達(dá)1例，強(qiáng)陽性表達(dá)1例，弱陽性表達(dá)1例；MGMT基因啟動子甲基化的3例，非甲基化的3例。免疫熒光顯示膠質(zhì)瘤細(xì)胞均有GM-CSFRα的表達(dá)。
　　2.時間-細(xì)胞存活率TMZ組、GM-CSF+TMZ組均在培養(yǎng)約72小時后顯示出較

7、低的細(xì)胞存活率，對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率達(dá)到最高。
　　3.MTT法細(xì)胞存活率檢測6例細(xì)胞GM-CSF組的細(xì)胞存活率與對照組相比均有不同程度的增加，TMZ組與GM-CSF+TMZ組的細(xì)胞存活率均比對照組明顯下降。MGMT基因啟動子甲基化的3例細(xì)胞，GM-CSF+TMZ組的細(xì)胞存活率(67.67±1.16，68.13±1.06,68.42±1.73)比TMZ組（90.00±1.73，82.33±1.53,82.67±2.11）顯著降低（

8、P=0.000，P=0.000，P=0.001），MGMT啟動子非甲基化的3例細(xì)胞GM-CSF+TMZ組與TMZ組存活率均無顯著差異（P＞0.05）。
　　4.流式細(xì)胞周期結(jié)果分析6例細(xì)胞GM-CSF組（35.32±1.69，26.47±4.74，57.33±2.79，33.78±3.42，34.10±2.90，19.41±1.61）的G1期細(xì)胞比例（%）均比對照組（89.91±4.08，71.24±6.91，81.15±4.07

9、，85.53±1.39，64.42±5.23，66.06±5.97）降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；而S期細(xì)胞比例（%）GM-CSF組（55.87±4.07，46.91±4.99，35.28±3.34，35.73±6.05，56.79±2.76，50.78±1.51）較對照組（2.19±2.26，22.08±2.07，19.13±3.25，14.51±1.38，28.97±3.51，26.51±4.64）顯著增加（P＜0.05）。

10、
　　5.流式細(xì)胞凋亡結(jié)果分析GM-CSF組與對照組相比，6例細(xì)胞的GM-CSF組細(xì)胞凋亡率均降低；MGMT啟動子甲基化的3例細(xì)胞GM-CSF+TMZ組凋亡率（19.91±1.93，25.33±2.57，32.15±2.85）與單藥TMZ組凋亡率（10.79±0.60，15.15±1.74，22.27±1.89）相比均顯著增加，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000，P=0.000，P=0.007）；MGMT啟動子非甲基化的3例細(xì)胞

11、GM-CSF+TMZ組與單藥TMZ組細(xì)胞凋亡率無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.TMZ對GM-CSF干預(yù)后的高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制率隨時間變化逐漸增高。
　　2.GM-CSF可增強(qiáng)TMZ對MGMT基因啟動子甲基化的高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，而對MGMT基因啟動子非甲基化高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效果不明顯。
　　3.GM-CSF可誘導(dǎo)高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期由G1期快速進(jìn)入S期，從而提高TMZ對高級別膠