東亞鉗蝎氯毒素(BmK CT)聯(lián)合替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的研究.pdf

1、東亞鉗蝎氯離子通道毒素（BmK CT）是蝎氯毒素的一個(gè)亞型，由36個(gè)氨基酸組成，含有4對(duì)二硫鍵，與以色列金蝎氯離子通道毒素有68％的同源性且具有相似的生物學(xué)功能。BmK CT能選擇性抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面廣泛分布的氯離子通道，并且能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的分泌和活性，從而抑制膠質(zhì)瘤增殖、遷移和侵襲的能力。BmK CT在膠質(zhì)瘤診斷和治療上的應(yīng)用主要是兩方面：一是介導(dǎo)納米藥物的靶向給藥；二是輔助造影，準(zhǔn)確判斷膠質(zhì)瘤和正

2、常腦組織的邊緣界限。
　　神經(jīng)膠質(zhì)瘤（Glioma）是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，約占所有腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%和所有惡性腦腫瘤的80%。患有惡性膠質(zhì)瘤病人的平均生存期在過去幾十年并沒有明顯的延長(zhǎng)，仍然保持在一年左右。替莫唑胺（TMZ）作為一種小分子口服化療藥，是治療惡性膠質(zhì)瘤的首選藥物。TMZ的主要功能是使膠質(zhì)瘤細(xì)胞的O6甲基鳥嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶失活，引起DNA損傷，最終導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。然而，化療耐藥性的存在導(dǎo)致了療效的

3、不佳。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期證實(shí)BmK CT能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，但是其分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究首先將探討B(tài)mK CT抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的機(jī)制，其次驗(yàn)證BmK CT能否緩解TMZ的化療耐藥性，增強(qiáng)其對(duì)膠質(zhì)瘤的殺傷作用。
　　本研究構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-BmK CT，轉(zhuǎn)化至BL21表達(dá)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、表達(dá)和純化，最后將重組蛋白GST-BmK CT濃縮至6 mg/ml。利用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)GST-Bm

4、K CT能抑制U251細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2，MMP-2分泌抑制與 GST-BmK CT作用劑量呈正相關(guān)性。細(xì)胞劃痕擦傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其能抑制 U251細(xì)胞的遷移。
　　本研究結(jié)果顯示，融合蛋白 GST-BmK CT能特異地抑制 U251細(xì)胞的增殖。GST-BmK CT刺激U251細(xì)胞96h，細(xì)胞周期各時(shí)相發(fā)生了明顯的改變，U251細(xì)胞周期在S期和G2/M期發(fā)生阻滯。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)GST-BmK CT能選擇性的激活p38α，當(dāng)

5、用 p38MAPK信號(hào)通路特異性的抑制劑 SB203580預(yù)處理 U251細(xì)胞后再用GST-BmK CT做刺激發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期各時(shí)相空白對(duì)照組相比在S期和G2/M期幾乎沒有阻滯，表明 p38α在 GST-BmK CT誘導(dǎo)的 U251細(xì)胞周期阻滯中起重要作用。MAPKAPK-2是p38αMAPK下游的一個(gè)直接激活靶標(biāo)，更是一個(gè)DNA損傷細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶，本研究首次證實(shí)GST-BmK CT刺激U251細(xì)胞后，MAPKAPK-2被激活，當(dāng)用

6、SB203580預(yù)處理后，MAPKAPK-2的激活明顯減弱，更進(jìn)一步證明了GST-BmK CT激活p38αMAPK信號(hào)通路的選擇性。
　　有報(bào)道證實(shí)TMZ作用膠質(zhì)瘤細(xì)胞引起的凋亡是由于抑制了mTOR的激活，但是同時(shí)也導(dǎo)致了 Akt的進(jìn)一步激活，這是導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生的原因之一。我們發(fā)現(xiàn)GST-BmK CT能選擇性地抑制 AKT的活化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其能激活 PTEN的轉(zhuǎn)錄，而GST和TMZ均無此功能。當(dāng)GST-BmK CT與TMZ聯(lián)合使用的

7、時(shí)候，能更有效地誘導(dǎo)U251細(xì)胞周期阻滯和凋亡。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GST-BmK CT作用U251細(xì)胞后，能顯著下調(diào)Bcl2的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax、Caspase3和Caspase9的表達(dá)。GST-BmK CT聯(lián)合TMZ能更快的誘導(dǎo)Bcl2表達(dá)的下調(diào)和Caspase9表達(dá)的上調(diào)，加快凋亡信號(hào)的產(chǎn)生。這部分內(nèi)容證實(shí)了GST-BmK CT通過抑制Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)了TMZ的細(xì)胞毒性，從而更加有效的誘導(dǎo)U251細(xì)胞周期阻滯和凋亡。我們推測(cè)GS