替莫唑胺聯(lián)合應(yīng)用鋰劑以及全反式維甲酸對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：
　　膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見惡性腫瘤，而惡性程度最高的則是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)。GBM侵襲性強(qiáng)，進(jìn)展迅速，常浸潤于正常腦組織中，手術(shù)難以全部切除，因此容易復(fù)發(fā)。目前治療方式雖然結(jié)合了手術(shù)切除及術(shù)后聯(lián)合放化療，但患者平均生存期仍只有14個(gè)月，五年生存率約為10％。
　　目前膠質(zhì)瘤化療最主要應(yīng)用的化療藥物為替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)，理論上，特定DNA修復(fù)酶如O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(06-m

2、ethylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)的存在，可以導(dǎo)致TMZ耐藥，這使得替莫唑胺的應(yīng)用遇到了瓶頸。因此尋找特異性強(qiáng)，可與現(xiàn)行化療藥物TMZ聯(lián)合應(yīng)用，對機(jī)體損傷小的抗腫瘤藥物成為研究的新方向。
　　由于膠質(zhì)瘤對于機(jī)體自身免疫功能的抑制，以及瘤體本身免疫性質(zhì)的改變，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)難以對腫瘤組織產(chǎn)生殺傷作用，因此，尋找既能作用于腫瘤增殖和侵襲，又能調(diào)整腫瘤免疫學(xué)特性的新化療藥物是我們進(jìn)一步研究

3、的方向。
　　全反式維甲酸(All-Trans Retinoic Acid，ATRA)是在臨床治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物，屬于促分化劑，對于細(xì)胞的分化以及凋亡均產(chǎn)生影響，對于機(jī)體免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)已有研究顯示ATRA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞也具有誘導(dǎo)分化以及抑制增殖的能力。
　　鋰劑(Lithium)廣泛應(yīng)用于精神疾病的藥物，目前已知為GSK3-β抑制劑，GSK3參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程，同時(shí)也參與了體內(nèi)免疫細(xì)胞的分化，

4、并于某些腫瘤中屬于致癌基因。
　　這兩種制劑均可以通過NFAT1通路發(fā)揮作用。NFAT1為調(diào)節(jié)T細(xì)胞的重要因子，同時(shí)廣泛存在于人體各個(gè)部位，NFAT1于膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)已在我們先前的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，因此本研究我們應(yīng)用上述兩種具有免疫調(diào)節(jié)功能的臨床藥物作為研究對象，探討他們與替莫唑胺的聯(lián)合效果，并驗(yàn)證聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲力、凋亡、免疫表達(dá)是否有所影響，從而試圖建立新的聯(lián)合化療方案。
　　方法：
　　一、細(xì)胞

5、和細(xì)胞培養(yǎng)
　　1、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG、U251-MG從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購得，并于中國醫(yī)科大學(xué)基因組實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37℃，100U/ml青霉素，1001μg/ml鏈霉素和5％CO2條件在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2、MTS法評估TMZ、ATRA與Lithium對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響
　　收集對數(shù)增長期的人膠質(zhì)瘤U87-MG、U251-MG，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度1×103

6、個(gè)，接種到96孔板，5％CO2,37℃過夜，使細(xì)胞貼附至96孔板以后，加入含有Temozolomide(12.5、25、50、100μM), All Trans Retinoic Acid(1、10、30、50、100μM)，Lithium chloride(1、5、10、20 mM)和Control(2μl DMSO)的培養(yǎng)基200μl，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加入20μl MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。終止培養(yǎng)，在酶聯(lián)儀上震蕩10秒后，OD4

7、90nm下測量各孔吸光值。
　　3、Transwell法測定TMZ與Lithium對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲力的影響
　　在具有直徑為8μm微孔基底膜的小室內(nèi)預(yù)先鋪好基質(zhì)膠。5×104的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞連同200μl的培養(yǎng)基(含0.2％FBS)置于上室，下室加入500μl的培養(yǎng)基(含20％FBS)。上室內(nèi)加入Temozolomide(5、50、100μM)、Lithium chloride(5、20mM)以及Control(2μl D

8、MSO)，5％CO2，37℃孵育24小時(shí)后，用棉簽擦去上室的基質(zhì)膠和細(xì)胞，PBS清洗一次，放入甲醇中固定1分鐘，風(fēng)干后蘇木精染色3分鐘，PBS清洗一次，伊紅染色15秒，PBS清洗3次，風(fēng)干后將基底膜切下，固定于蓋玻片上，選擇6個(gè)視野200高倍鏡下計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　4、RNA提取及Real Time PCR檢測MHC分子、TGF-β、B7-H1的表達(dá)
　　采用Trizol試劑一步法提取U251細(xì)胞總RN

9、A。紫外分光光度計(jì)檢測OD260/OD280及核酸濃度，使用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較處理以及未處理樣品的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異
　　5、流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期變化
　　U251-MG細(xì)胞加入All-Trans Retinoic Acid（1、10μM），Lithium chloride(5、20mM)以及Control(2μl DMSO/200μl培養(yǎng)液)，培養(yǎng)24與72小時(shí)。上機(jī)檢測前收集細(xì)胞、進(jìn)行固定、PI染色。

10、r>　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Windows SPSS19統(tǒng)計(jì)軟件分析。組間比較使用t檢驗(yàn)。P≤0.05認(rèn)為有顯著性差異。CellQuest software用于流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：
　　1、TMZ、ATRA與Lithium的應(yīng)用可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖
　　MTS結(jié)果表明，TMZ+Lithium組，ATRA+Lithium組在48與72小時(shí)內(nèi)與對照組相比均有顯著性差異。(P≤0.05

11、)
　　2、TMZ與Lithium對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性有抑制
　　單獨(dú)或是共同使用TMZ和Lithium，對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞與對照組相比，均有侵襲力降低，合并應(yīng)用時(shí)，在TMZ低劑量組加入Lithium與單獨(dú)應(yīng)用TMZ的侵襲力抑制增加。（P≤0.05）
　　3、MHC分子、TGF-β、B7-H1在應(yīng)用ATRA與Lithium后表達(dá)的改變由于ATRA與Lithium對于NFAT1的調(diào)節(jié)互異，導(dǎo)致合用后MHC、TG

12、F-β與B7-H1的表達(dá)量并無有意義的改變。MHC分子在單獨(dú)應(yīng)用Lithium或是ATRA高劑量時(shí)表達(dá)量降低;TGF-(a)在單獨(dú)應(yīng)用Lithium與ATRA時(shí)，并未出現(xiàn)有意義的表達(dá)量改變;而在B7-H1的表達(dá)量在單獨(dú)應(yīng)用Lithium時(shí)可見表達(dá)量增加，且成劑量依賴，但單獨(dú)應(yīng)用維甲酸時(shí)并未出現(xiàn)有意義的改變。
　　4、應(yīng)用ATRA與Lithium于U251細(xì)胞，未能產(chǎn)生細(xì)胞凋亡
　　無論是單獨(dú)使用Lithium，或是與ATRA

13、合用，U251細(xì)胞系均未能產(chǎn)生凋亡，但是S期出現(xiàn)阻滯。(P≤0.05)
　　結(jié)論：
　　不論是單獨(dú)或是共同應(yīng)用ATRA以及Lithium，均可對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251產(chǎn)生增殖抑制，TMZ與Lithium的聯(lián)合應(yīng)用也可增強(qiáng)TMZ的抑制增殖效果。由于ATRA與Lithium對于NFAT1的調(diào)控是反向的，在MHC、TGF-β、B7-H1的mRNA表達(dá)上，無法體現(xiàn)出有效的影響效果。在細(xì)胞周期中，U251細(xì)胞對于ATRA、Lit