替莫唑胺通過(guò)影響TGF+β2降低膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲性.pdf

1、研究背景：
　　 膠質(zhì)瘤是原發(fā)性腦腫瘤中發(fā)病率最高且預(yù)后較差的腫瘤,流行病學(xué)調(diào)查顯示,膠質(zhì)瘤約占原發(fā)性腦腫瘤的一半左右,且近年來(lái)還有上升的趨勢(shì)。在過(guò)去二十年里,化療藥物治療膠質(zhì)瘤經(jīng)歷了很多挑戰(zhàn);伴隨替莫唑胺(temozolomide,TMZ)的發(fā)現(xiàn),化療藥物治療膠質(zhì)瘤取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。替莫唑胺是一種新型口服烷化劑藥物,血腦屏障透過(guò)率高,能夠延長(zhǎng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的生存時(shí)間。除此之外,由于它的低毒性,替莫唑胺是長(zhǎng)期治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥

2、物的首選。神經(jīng)外科醫(yī)生在膠質(zhì)瘤治療上已經(jīng)做了很多臨床和基礎(chǔ)工作,但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后仍然非常差,中位生存時(shí)間只有14.6個(gè)月[4],5年生存率仍然小于50%。烷化劑治療后腫瘤復(fù)發(fā)的機(jī)制可能與DNA修復(fù)基因有關(guān),如MGMT,MSH2和MSH6。
　　 膠質(zhì)瘤的主要組織學(xué)特征是具有不同階段的分化細(xì)胞群和形態(tài)的異質(zhì)性。這種腫瘤的異質(zhì)性可能會(huì)造成治療上的挑戰(zhàn),因?yàn)椴煌[瘤組織內(nèi)的細(xì)胞群可能對(duì)治療產(chǎn)生不同的反應(yīng)?？朔@些問(wèn)題的策略之一

3、是確定和描述不同的亞群,找出特定疾病的共同特征,如腫瘤的發(fā)生、腫瘤復(fù)發(fā)或兩者兼而有之。在定義上,干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞有重疊之處;特別是在不斷增殖方面,基因表達(dá)的異常與干細(xì)胞行為在腫瘤生物學(xué)發(fā)揮了作用。因此人們推測(cè),在腫瘤細(xì)胞中存在干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞,它在腫瘤細(xì)胞中所占比例相對(duì)較小,具有抗腫瘤治療的可能性。2001年Reya等用實(shí)驗(yàn)證明,白血病和多種實(shí)體瘤只有為數(shù)不多的一類(lèi)特殊細(xì)胞,具有無(wú)限增殖、自我更新和多向分化潛能;通過(guò)比較干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞

4、,他們發(fā)現(xiàn)二者具有相似的生物學(xué)特性,提出腫瘤干細(xì)胞(Cancerstemcells,CSCs)學(xué)說(shuō)。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)可以很好的解釋腫瘤發(fā)生與腫瘤耐藥。Singh等利用神經(jīng)球懸浮生長(zhǎng)法從腦腫瘤組織中分離出一小群具有自我更新、不斷增殖和多向分化能力的細(xì)胞,提出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(gliomastemcells,GSCs)學(xué)說(shuō)。人們推測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療耐藥可能與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞有關(guān),而且膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的化療耐藥比我們想象的要復(fù)雜。Gaspar等發(fā)現(xiàn)Sonic

5、Hedgehog和Notch信號(hào)通路與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的化療耐藥有關(guān)。
　　 膠質(zhì)瘤預(yù)后較差的原因可能是由于其具有侵襲性,它可以通過(guò)白質(zhì)纖維遷移到周?chē)X組織從而逃避手術(shù)治療。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移,是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程,涉及到多種生物學(xué)特性。尤其是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,其侵襲性要比分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞高。很多研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor,TGF)-β2可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲。TGF-β2,作為一個(gè)主要

6、調(diào)節(jié)人腦膠質(zhì)瘤免疫抑制的因子,與膠質(zhì)瘤的預(yù)后及進(jìn)展緊密相。TGF-β2可以通過(guò)提高基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)和αvandβ3整聯(lián)蛋白(integrin)的表達(dá)影響細(xì)胞侵襲功能。
　　 因此我們想深入的研究替莫唑胺對(duì)于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用,尤其是對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲的影響,以及是否通過(guò)TGF-β2影響膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲。從而能提高替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤的治療效果,改變傳統(tǒng)的膠質(zhì)瘤治療方案,為膠

7、質(zhì)瘤患者延長(zhǎng)生命、甚至長(zhǎng)期存活打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 1、從原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞(primaryculturedgliomacells,PCGCs)獲得懸浮培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞球,并進(jìn)行鑒定證明是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。
　　 2、研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的侵襲能力。
　　 3、替莫嘩胺是否影響膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲性。
　　 4、觀察替莫唑胺是否通過(guò)TGF-β2影響膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲能力。
　　 方法：<

8、br>　　 第一部分:獲得的膠質(zhì)瘤細(xì)胞標(biāo)本通過(guò)胰蛋白酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng),得到PCGCs:PCGCs加入含有生長(zhǎng)因子(EGF,bFGF,B27)DEME/F12無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng),獲得懸浮生長(zhǎng)的腫瘤球細(xì)胞。通過(guò)免疫熒光染色及分化實(shí)驗(yàn),證明懸浮生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞球?yàn)镚SCs。
　　 第二部分:Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)比較GSCs和PCGCs的侵襲能力:TMZ是否抑制GSCs的侵襲能力。
　　 第三部分:實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄.聚

9、合酶鏈反應(yīng)(realtimeReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,realtimeRT-PCR)檢測(cè)TMZ對(duì)GSCs中TGF-β2mRNA表達(dá)水平影響,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測(cè)TMZ對(duì)GSCs作用后上清液中TGF-β2蛋白表達(dá)水平影響。分別添加外源性TGF-β2和TGF-β2抗體,Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)證

10、實(shí)TMZ通過(guò)TGF-β2影響GSCs侵襲。
　　 第四部分:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有的定量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定
　　 獲得的膠質(zhì)瘤標(biāo)本通過(guò)胰蛋白酶消化法得到貼壁生長(zhǎng)的PCGCs。PCGCs在含有EGF、bFGF、B27的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天后可以觀察到懸浮生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)

11、胞球:腫瘤細(xì)胞球生長(zhǎng)穩(wěn)定,可以傳代。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)腫瘤細(xì)胞球表達(dá)CD133,說(shuō)明培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞球?yàn)镚SCs。GSCs在含10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后,腫瘤細(xì)胞球貼壁生長(zhǎng),腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣,大小不一,以梭形為主,有的細(xì)胞突觸很長(zhǎng),原有的形態(tài)消失。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞表達(dá)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化的標(biāo)記物:膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(膠質(zhì)纖維酸性蛋白,glialfibrillaryacid

12、icprotein,GFAP)和神經(jīng)元標(biāo)記物(β-Ⅲ-tubulin)。
　　 二、TMZ可以降低GSCs侵襲能力
　　 對(duì)4個(gè)來(lái)自不同患者的膠質(zhì)瘤標(biāo)本培養(yǎng)出的GSCs和PCGCs進(jìn)行了Transwell體外侵襲力比較,我們發(fā)現(xiàn)GSCs的侵襲力要強(qiáng)于PCGCs。應(yīng)用相同的方法,我們證實(shí)TMZ可以抑制GSCs的侵襲能力。為了說(shuō)明這一現(xiàn)象不是由于TMZ對(duì)GSCs增殖抑制作用引起的,我們進(jìn)行了MTT實(shí)驗(yàn)并證實(shí)在24小時(shí)內(nèi)TMZ

13、沒(méi)有抑制GSCs增殖。
　　 三、TMZ通過(guò)降低TGF-β2表達(dá)來(lái)抑制GSCs侵襲性
　　 1、TMZ可以降低GSCs中TGF-β2mRNA表達(dá)水平。
　　 2、ELISA結(jié)果說(shuō)明TMZ可以降低GSCs上清液中TGF-β2蛋白表達(dá)水平。
　　 3、TGF-β2可以增加GSCs的侵襲力。
　　 4、TMZ對(duì)GSCs的侵襲抑制與TGF-β2表達(dá)含量減少有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1、P