沙利度胺與替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞黏附、侵襲以及整合素表達(dá)機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，是星形細(xì)胞腫瘤中侵襲能力最強(qiáng)的類型，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后很差，即使給予手術(shù)治療并輔以放療和化療，病人的中位生存期仍然小于1年。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是一種新型二代口服烷化劑，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤有顯著的抗腫瘤作用，沙利度胺(thalidomide，THD)是一種谷氨酸衍生物，其具體作用機(jī)制尚不完全清楚，一般認(rèn)為THD可通過(guò)抑制整合素αvβ3、αvβ5的表達(dá)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因

2、子等介導(dǎo)的生血管作用來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)間質(zhì)的黏附與血管生成。THD能增強(qiáng)TMZ對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的治療作用。本實(shí)驗(yàn)主要研究THD、TMZ以及THD與TMZ聯(lián)合應(yīng)用對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞αvβ3整合素受體表達(dá)、黏附、遷移與侵襲的影響，進(jìn)而探討THD增強(qiáng)TMZ對(duì)惡性膠質(zhì)瘤治療作用的潛在機(jī)理。 方法： ①制備膠質(zhì)瘤來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)，并在鋪被有細(xì)胞外基質(zhì)的培養(yǎng)皿中分別以加入THD(100μg/ml)、TMZ(100μM)以及THD+TMZ(100

3、μg/ml+100μM)的培養(yǎng)液培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229細(xì)胞，對(duì)照組加入等體積溶媒(DMSO)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁過(guò)程及形態(tài)變化。 ②檢測(cè)各組LN229細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ3的陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度(meanfluorescence intensities，MFI)首先用磺酰羅丹明B(SRB)比色法分別測(cè)定各組懸浮細(xì)胞的存活率。各組細(xì)胞培養(yǎng)4h后取懸浮細(xì)胞，并用0.25％胰酶消化貼壁細(xì)胞，充分懸浮細(xì)胞。取細(xì)胞(1×1

4、04)200g離心5min，棄上清。用含1％牛血清白蛋白的PBS洗滌2遍后加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人整合素αvβ3抗體及其同型對(duì)照，于4℃孵育45min，PBS再次洗滌，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。獲得陽(yáng)性細(xì)胞比例以及MFI值。 ③檢測(cè)各組細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的能力將LN229細(xì)胞以5×104/ml的密度接種于鋪被有同種細(xì)胞來(lái)源的ECM的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基內(nèi)含有THD、T

5、MZ、THD+TMZ以及等量溶媒，培養(yǎng)60分鐘。輕輕吸出細(xì)胞懸液，用預(yù)溫的PBS洗三次，除去未黏附細(xì)胞。每孔加入10％戊二醛100μl固定30分鐘，0.1％結(jié)晶紫染色細(xì)胞后在酶標(biāo)儀上測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值。 ④評(píng)價(jià)各組LN229細(xì)胞侵襲與遷移能力建立Transwell小室模型與劃痕損傷模型，觀察各組體外培養(yǎng)的LN229膠質(zhì)瘤細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的數(shù)量與細(xì)胞遷移的距離，并以此反映各組藥物對(duì)細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響。

6、 結(jié)果： ①溶媒對(duì)照組與TMZ單藥組大多數(shù)LN229細(xì)胞迅速形成偽足并與其他細(xì)胞接觸形成單細(xì)胞層。THD和TMZ聯(lián)合組有大量LN229細(xì)胞呈游離狀態(tài)，貼壁細(xì)胞的偽足短仍保持類圓形。 ②THD與TMZ對(duì)細(xì)胞整合素αvβ3表達(dá)的影響 SRB法檢測(cè)懸浮細(xì)胞的存活率，對(duì)照組及TMZ組懸浮細(xì)胞很少，故忽略不計(jì)。THD組懸浮細(xì)胞OD值為0.216，聯(lián)合組懸浮細(xì)胞OD值為0.209，兩組懸浮細(xì)胞生存率分別為93.5％，90.5％。

7、各組懸浮細(xì)胞生存率都在90％以上。 流式細(xì)胞計(jì)檢測(cè)顯示THD組和聯(lián)合組LN229整合素αvβ3表達(dá)減弱，其中貼壁細(xì)胞整合素αvβ3的陽(yáng)性表達(dá)率分別為對(duì)照組的81.8％與77.9％，平均熒光強(qiáng)度(MFI)分別為對(duì)照組的66.8％、53.7％；懸浮細(xì)胞整合素αvβ3陽(yáng)性表達(dá)率更低，分別為對(duì)照組的63.7％、55.0％，MFI分別為對(duì)照組的49.8％、54.1％。而TMZ組αvβ3陽(yáng)性表達(dá)率為對(duì)照組的103.3％，MFI為對(duì)照組的90

8、.4％。 ③THD與TMZ對(duì)LN229細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)的作用：THD組與聯(lián)合組培養(yǎng)皿孔內(nèi)剩余的結(jié)晶紫染色的細(xì)胞明顯少于對(duì)照組和TMZ組(P均<0.05)，THD組與聯(lián)合組之間無(wú)差別，TMZ組與對(duì)照組間也無(wú)差異(P>0.05)。THD，TMZ，THD+TMZ組細(xì)胞黏附抑制率分別為25.23％、0.88％、26.83％。 ④THD與TMZ對(duì)LN229細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響侵襲實(shí)驗(yàn)中THD組與THD+TMZ組平均每視野侵

9、襲細(xì)胞數(shù)目小于TMZ組與對(duì)照組(P均<0.05)，但THD組與聯(lián)合組兩組間無(wú)差異(P>0.05)。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)中THD組與THD+TMZ組細(xì)胞與對(duì)照組相比遷移距離縮短(P<0.05)，THD組與聯(lián)合組間無(wú)差異(P>0.05)。TMZ組對(duì)照組間無(wú)差異(P>0.05)。 結(jié)論：THD具有影響細(xì)胞黏附于ECM的能力以及抑制細(xì)胞遷移與侵襲能力的作用，其機(jī)制可能與抑制或干擾膠質(zhì)瘤細(xì)胞αvβ3整合素受體的表達(dá)有關(guān)。替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞αvβ