替莫唑胺緩釋微球治療膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生率最高的腫瘤，目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的治療原則，還是強(qiáng)調(diào)以手術(shù)切除腫瘤為主的基礎(chǔ)上，聯(lián)合放療和化療，但療效并不滿意。近幾年在膠質(zhì)瘤化療方面取得了一些新的進(jìn)展，如替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是新一代烷化劑類化療藥，以其有效(中位生存期較傳統(tǒng)化療者延長(zhǎng)一個(gè)月)、低毒、使用方便(可口服)等特點(diǎn)，增強(qiáng)了我們對(duì)膠質(zhì)瘤化療的關(guān)注，為治療惡性膠質(zhì)瘤帶來(lái)了新的希望。 已有文獻(xiàn)報(bào)道，膠質(zhì)瘤切除后于瘤腔內(nèi)

2、放置卡莫斯汀(BCNU)緩釋片可提高局部藥物濃度，延緩腫瘤復(fù)發(fā)。有鑒于此，我們將TMZ制成緩釋微球(P-TMZ)，于腫瘤原位緩慢釋放，觀察其對(duì)膠質(zhì)瘤的化療療效。 第一部分替莫唑胺緩釋微球?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44體外抑瘤效應(yīng)的觀察 目的：觀察替莫唑胺緩釋微球在體外對(duì)SHG-44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的抑制效應(yīng)。 方法：將人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44復(fù)蘇后接種于含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，傳代5-6次后，取生長(zhǎng)狀態(tài)

3、良好的腫瘤細(xì)胞，以0.25％的EDTA-胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)液稀釋為1×104/ml，以100μl/孔接種于96孔板。設(shè)P-TMZ、TMZ、BCNU、P-0(空白微球)和空白對(duì)照五組，前四組每組設(shè)5個(gè)濃度(1μ g/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)，待測(cè)藥物用培養(yǎng)液混懸后加入相應(yīng)組內(nèi)(空白對(duì)照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液)。以MTT法測(cè)定替莫唑胺緩釋微球?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)，加藥96h后檢測(cè)不同藥

4、物濃度在570nm處的OD值，計(jì)算其IC50。 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示：P-TMZ、TMZ和BCNU對(duì)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的體外抑制效應(yīng)明顯，三者的IC50分別為6.63±0.26μg/ml、7.98±0.24μg/ml和8.41±0.26μg/ml，均低于10μg/ml，相對(duì)于空白微球(P-0)均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。結(jié)論： P-TMZ保留了TMZ的抑瘤活性，為進(jìn)一步研究其體內(nèi)抑瘤效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。 第二

5、部分替莫唑胺緩釋微球 治療人腦膠質(zhì)瘤皮下移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察替莫唑胺緩釋微球(P-TMZ)對(duì)SHG-44人腦膠質(zhì)瘤皮下移植瘤的抑瘤效應(yīng)。 方法：將SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞(1×107)注射于Balb/c裸小鼠右腋皮下，二周后待皮下移植瘤生長(zhǎng)至體積約100mm3，取出腫瘤再以組織塊接種的方法皮下傳代(2mm3/鼠)，待腫瘤生長(zhǎng)至約65mm3時(shí)，將荷瘤鼠隨機(jī)分為P-TMZ組、替莫唑胺(temozolomide，

6、TMZ)組、P-TMZ+TMZ聯(lián)合治療組、卡莫斯汀(BCNU)組、空白微球( P-O)陰性對(duì)照組和生理鹽水(NS)空白對(duì)照組，然后將P-TMZ(500mg/kg)、和P-O(500mg/kg)以DMEM培養(yǎng)液混懸至終體積150μl，分別經(jīng)皮多點(diǎn)穿刺緩慢注入腫瘤組織內(nèi)；TM250mg/kg灌胃，每日一次，連續(xù)5天；BCNU(40 mg/kg)尾靜脈注射一次；NS組為NS150μl瘤內(nèi)注射。每4天1次測(cè)量荷瘤鼠體重及皮下腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算

7、腫瘤體積。 結(jié)果：在皮下抑瘤實(shí)驗(yàn)中，P-TMZ、P-TMZ+TMZ和BCNU抑瘤效應(yīng)明顯，抑瘤率均明顯高于P-O、NS(P<0.01)，三種藥物抑瘤效應(yīng)亦優(yōu)于TMZ(P<0.05)，TMZ具有一定的抑瘤效應(yīng)，高于P-O、NS(P<0.05)。 結(jié)論：P-TMZ保留了TMZ的抑瘤活性，在皮下腫瘤局部應(yīng)用時(shí)抑瘤效果優(yōu)于TMZ。 第三部分替莫唑胺緩釋微球治療人腦膠質(zhì)瘤顱內(nèi)原位移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究 目的：建立人腦膠質(zhì)

8、瘤裸小鼠顱內(nèi)腫瘤模型，并觀察在此模型中替莫唑胺緩釋微球(P-TMZ)對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)。 方法：將2.0mm3SHG-44皮下移植瘤組織塊植入裸小鼠右尾狀核，于接種后0d、5d、10d、15d、20d、25d處死荷瘤鼠(每次3只)，解剖取全腦行連續(xù)腦軸位冰凍切片，HE染色后測(cè)量腫瘤最大層面處最短徑(a)和最長(zhǎng)徑(b)，根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積V=a2×b/2，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。同法制作裸小鼠腦內(nèi)移植瘤模型，接種后10天將動(dòng)物隨機(jī)

9、分為7組，設(shè)P-TMZ組、TMZ(灌胃)組、P-TMZ+TMZ(灌胃)聯(lián)合用藥組、TMZ(顱內(nèi)注入)組、BCNU(尾靜脈注射)組、P-O組和生理鹽水(NS)組，每組9只鼠。然后將P-TMZ(100mg/kg)、TMZ(50mg/kg，顱內(nèi)注入)和P-O(100mg/kg)以DMEM培養(yǎng)液混懸至終體積20μl，緩慢注入顱內(nèi)腫瘤組織內(nèi)，TMZ(50mg/kg，灌胃)每天灌胃一次，共5天，BCNU(40mg/kg)經(jīng)尾靜脈注射一次。治療28天

10、后處死小鼠，冰凍切片、HE染色、測(cè)量顱內(nèi)腫瘤大小。 結(jié)果：P-TMZ組、P-TMZ+TMZ組、BCNU組、TMZ(灌胃)組和TMZ(顱內(nèi)注入)組的顱內(nèi)腫瘤體積明顯小于P-O組、NS組(P<0.01)；P-TMZ組、P-TMZ+TMZ組、BCNU組三組間無(wú)明顯差異(P>0.05)，但三組抑瘤率均優(yōu)于TMZ灌胃組(P<0.01)，亦優(yōu)于TMZ(顱內(nèi)注入)組(P<0.05)，TMZ灌胃組與TMZ顱內(nèi)注入組無(wú)差異(P>0.05)。結(jié)論：