替莫唑胺納米緩釋微球的制備及其作用的實驗研究.pdf

1、研究背景:膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤,發(fā)病率高,是國人最常發(fā)生的十大腫瘤之一,膠質(zhì)瘤中約70％為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和間變性星形細(xì)胞瘤,惡性程度高,治療手段未取得突破性進(jìn)展[1]。目前膠質(zhì)瘤的治療手段以手術(shù)治療為主,輔以放療、化療、靶向治療等綜合治療措施[2]。但是惡性膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長,腫瘤組織與周圍正常腦組織之間分界不清,手術(shù)完全徹底切除腫瘤的可能性較小[3]。大約超過90%的膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)為瘤腔周圍2cm內(nèi)的復(fù)發(fā),這就為控制膠質(zhì)瘤生長提供

2、了新思路,即“局部用藥”,術(shù)后一定時間內(nèi)維持腫瘤局部一定濃度的治療藥物可能是使腫瘤靜止甚至消失、預(yù)防復(fù)發(fā)的有效方法[4]。
　　局部緩釋化療的重點在于緩釋和控釋兩方面,對于載體材料有較高要求。以可降解多聚體為藥物載體進(jìn)行顱內(nèi)惡性膠質(zhì)瘤化療較為成熟的制劑是以PCPP:SA為載體的BCNU緩釋劑型,具有良好的生物相容性和可降解性,無細(xì)胞毒性。該緩釋劑采用聚酸酐(PCPP-SA)作為緩釋載體,在應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)這類聚合物存在一定缺陷,如細(xì)

3、胞貼附力較弱,親水性差,酸性降解產(chǎn)物引起無菌性炎癥,在實驗及臨床應(yīng)用中觀察到局部腦組織內(nèi)炎細(xì)胞浸潤及腦水腫明顯,此外,在一些實驗過程中發(fā)現(xiàn),此類降解材料的組織相容性較差,周圍疤痕組織形成明顯,容易影響緩釋藥物的擴(kuò)散,降解的碎片無法及時吸收,在瘤腔內(nèi)游動,有導(dǎo)致腦室系統(tǒng)堵塞的危險[8,9]。
　　PLGA緩釋微球體系能夠控制微球大小、延緩藥物降解、延長藥物釋放時間、靶向釋放、降低藥物毒性和刺激性,是一種很好的緩釋藥物載體[10]。納

4、米載體在發(fā)揮其緩釋功效的同時,能夠進(jìn)一步開放血腦屏障,納米載體還具有靶向作用,同時納米載體表面可攜帶靶向配體,利用靶向配體可增加腫瘤細(xì)胞的攝取率[11]。
　　納米載體穿過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)后,藥物通過擴(kuò)散或載體降解的方式釋放到腦組織中發(fā)揮作用,可通過納米載體的材料和比例的變化控制納米載體的降解時間,從而控制藥物釋放的速度,起到緩釋或者控釋的作用[12]。生物納米囊可有效地靶向作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞,而不作用于膠質(zhì)細(xì)胞,是理想的腦腫瘤靶向

5、載體之一[13]。納米載體進(jìn)入人體后具有被動靶向性,易被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬而聚集于肝、脾等器官,不聚集于腦部?？梢杂糜H水性表面活性劑修飾納米載體,延長其體內(nèi)的半衰期,可增加腦靶向性[14,15]。
　　替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)是一種新型的咪唑四嗪類細(xì)胞周期非特異性藥物,近年來在國內(nèi)外臨床上使用,為治療膠質(zhì)瘤帶來了突破。雖然替莫唑胺的毒副作用較其他化療藥物明顯減輕,但其骨髓抑制作用非常明顯[16]。局部給藥有以

6、下優(yōu)點:(1)直接作用于腫瘤部位,避開了血腦屏障,增加了腦腫瘤化療藥物選擇范圍;(2)能提高局部藥物濃度,減少全身毒性作用;(3)膠質(zhì)瘤常為局部復(fù)發(fā),其90%均在原發(fā)腫瘤切除部位周圍的2cm范圍內(nèi)復(fù)發(fā),這就使其非常適合進(jìn)行局部化療[17]。
　　本實驗擬制備替莫唑胺-PLGA納米緩釋微球,以PLGA為載體,藥物采用替莫唑胺,同時對TMZ-PLGA納米緩釋微球的制備工藝、體外釋放規(guī)律及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行研究,為膠質(zhì)瘤的間質(zhì)

7、內(nèi)化療提供一條新的思路和方法,同時為提高膠質(zhì)瘤病人的生存提供切實可行的治療措施。
　　本實驗分為兩部分:
　　1.藥物緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建及參數(shù)測定
　　2.藥物緩釋系統(tǒng)體外抗C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的研究
　　第一部分:藥物緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建及參數(shù)測定
　　研究目的:本部分?jǐn)M制備不同分子量的替莫唑胺-PLGA緩釋微球,分析制作參數(shù)、形態(tài)特征及體外釋放曲線。
　　研究方法:用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法制備替莫唑胺-PLGA納米

8、緩釋微球。用顯微鏡觀察四種不同分子量的緩釋微球的表面形態(tài)特征,并測量微球直徑。利用高效液相色譜儀,檢測載藥量和包封率。利用高效液相色譜法檢測微球中剩余的TMZ量,從而計算出不同時段釋放藥物量,繪制釋放曲線。
　　研究結(jié)果顯示替莫唑胺-PLGA緩釋微球的制作條件比較嚴(yán)格,溫度控制要求高,采用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法能夠獲得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、大小均勻的緩釋微球。分子量越大,微球直徑越大。光鏡及電鏡觀察,微球表面光滑,沒有裂隙,微球聚集不明顯,微球

9、大小均勻。實驗中制備的不同分子量的TMZ-PLGA緩釋微球最大載藥量為10.2%,所有緩釋微球的包封率都在90%以上,保證藥物的損失量極少。二氯甲烷殘留量測定結(jié)果:樣品二氯甲烷殘留量為5.70‰,低于國外文獻(xiàn)報道的3%,達(dá)到了顱內(nèi)應(yīng)用的要求。從替莫唑胺-PLGA緩釋微球的釋放曲線可以看出,緩釋系統(tǒng)中替莫唑胺可以持續(xù)釋放2周以上,符合間質(zhì)內(nèi)化療所要求的周期。
　　結(jié)論:PLGA非常適合作為制備緩釋微球的載體。所制備的替莫唑胺-PLG

10、A緩釋微球符合生物力學(xué)規(guī)律,可以減輕突釋效應(yīng),延長藥物緩釋時間。所制備的不同分子量及不同載藥量的緩釋微球均能長時間持續(xù)釋放替莫唑胺。
　　第二部分:藥物緩釋系統(tǒng)體外抗C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的研究
　　研究目的:分析替莫唑胺-PLGA緩釋微球在體外是否有持續(xù)抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力。觀察緩釋微球?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、壞死以及細(xì)胞活性的影響。
　　研究方法:細(xì)胞培養(yǎng)并傳代后,將C6細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板內(nèi):將樣品分為二組:實驗組、空白

11、對照組。試驗組:加入替莫唑胺-PLGA緩釋微球,按載藥量分為2.5%、5%、7.5%及10%組;空白對照組:不加入任何藥物。所有樣品放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一半樣品用多參數(shù)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率,另一半樣品利用全自動酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞活性。
　　研究結(jié)果顯示2.5%、5%、7.5%及10%TMZ-PLGA緩釋微球作用于膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測證實各個實驗組均對C6細(xì)胞有殺滅作用,并且隨載藥量增加效果增強(qiáng)。MTT法檢測第1、2、3

12、d的膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的細(xì)胞活性,實驗組與對照組進(jìn)行方差分析均有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。2.5%組與7.5%組、5%組與7.5%組、2.5%組與10%組、5%組與10%組有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異,7.5%組與10%組無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。證實在一定范圍內(nèi)載藥量越高,抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用越大。
　　結(jié)論:本研究所制備的不同載藥量的PLGA緩釋微球均對膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞有抑制殺滅作用。載藥量高的緩釋微球抑制腫瘤活性的作用高于載藥量低的緩釋微球。載藥量越