塞來昔布聯(lián)合替莫唑胺對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 本研究旨在檢測環(huán)氧化物酶-2(COX-2)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞中的表達(dá);觀察塞來昔布和替莫唑胺聯(lián)合作用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞時的體外抗瘤效應(yīng);探討其可能的相關(guān)機(jī)制，旨在為進(jìn)一步開展以COX-2為靶點(diǎn)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、檢測神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞中COX-2的表達(dá)
　　 體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞，在相應(yīng)的條件下培養(yǎng)一定的時間后

2、，分別采用免疫組織化學(xué)染色法和Western Blot法檢測COX-2在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2、塞來昔布聯(lián)合替莫唑胺對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的體外抗瘤效應(yīng)研究
　　 (1)根據(jù)干預(yù)因素不同，實(shí)驗(yàn)分組分為四組，分別為:
　　 ①空白對照組（不加任何藥物干預(yù)）;
　　 ②單用塞來昔布組（僅僅使用塞來昔布）;
　　 ③單用替莫唑胺組（僅僅使用替莫唑胺）;
　　 ④聯(lián)合

3、用藥組（聯(lián)合應(yīng)用塞來昔布和替莫唑胺）。
　　 (2)體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞，培養(yǎng)至80％細(xì)胞密度時，按照上述分組給予藥物干預(yù)，作用72小時，分別從一下幾個方面進(jìn)行檢測:
　　 ①在倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;
　　 ②采用MTT比色法檢測各組細(xì)胞增殖情況變化;
　　 ③以Annexin V-FITC/PI雙染法在流式細(xì)胞儀上檢測各組細(xì)胞早期及晚期凋亡率變化;
　　 ④采用H

4、oechst33258染色的方法在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。
　　 (3)體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞，培養(yǎng)至80％細(xì)胞密度時，制作劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，按照上述分組給予藥物干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時后在倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞遷移能力變化。
　　 3、塞來昔布聯(lián)合替莫唑胺對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞作用的可能機(jī)制研究
　　 體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞，培養(yǎng)至80％細(xì)胞密度時，根據(jù)上述

5、分組給予藥物干預(yù)，藥物作用72小時后，以Western Blot法檢測各組細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞中COX-2的表達(dá)
　　 (1)免疫組織化學(xué)染色法檢測神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞中COX-2的表達(dá):COX-2一般存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在免疫組織化學(xué)的玻片中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的胞漿和胞核中均可見明顯的棕黃色顆粒，COX-2蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U25

6、1細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。
　　 (2) Western Bolt法檢測神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞中COX-2表達(dá):通過Western Blot的方法我們發(fā)現(xiàn)，COX-2蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。
　　 2、塞來昔布聯(lián)合替莫唑胺對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的體外抗瘤效應(yīng)研究
　　 (1)在倒置相差顯微鏡下觀察藥物干預(yù)后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:空白對照組細(xì)胞數(shù)目較多，細(xì)胞生長狀態(tài)

7、良好，細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)呈長梭形，細(xì)胞透亮度較大，折光性較好，增殖較快。單用替莫唑胺組和塞來昔布組的細(xì)胞體積較空白對照組縮小、變圓，透亮度減小，折光性減弱，細(xì)胞間連接減少，其中以替莫唑胺組顯著，聯(lián)合用藥組細(xì)胞體積縮小、折光性減弱更加顯著，細(xì)胞周圍出現(xiàn)了點(diǎn)片狀碎片，大量細(xì)胞崩解、漂浮，培養(yǎng)液明顯變得渾濁。
　　 (2) MTT比色法檢測藥物干預(yù)后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞增殖速度變化:通過MTT比色法我們發(fā)現(xiàn):空白對照組OD值為:

8、0.79±0.03，塞來昔布組OD值0.68±0.03，替莫唑胺組OD值0.61±0.04，聯(lián)合用藥組OD值0.45±0.13;與空白對照組相比較，其他各藥物干預(yù)組OD值均明顯降低(P＜0.01)，增殖速度下降，而與塞來昔布組、替莫唑胺組比較，聯(lián)合用藥組OD值也顯著下降(P＜0.01)增殖速度顯著下降。
　　 (3) Annexin V-FITC/PI雙染法檢測藥物干預(yù)后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞凋亡率變化:對照組、塞來昔布組、

9、替莫唑胺組、聯(lián)合用藥組各組細(xì)胞培養(yǎng)72小時，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率分別為4.20％±0.33％、19.12％±0.91％、24.76％±0.87％、42.98％±0.56％。與對照組相比，各干預(yù)組細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P＜0.01)，而聯(lián)合用藥組細(xì)胞的凋亡率比明顯高于塞來昔布組和替莫唑胺組(P＜0.01)。同時我們分別比較了藥物作用后，U251細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡或壞死細(xì)胞率，與對照組相比，各藥物干預(yù)組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡或

10、壞死細(xì)胞率凋亡率也明顯增加(P＜0.01），與塞來昔布組和替莫唑胺組相比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡或壞死細(xì)胞率均明顯增高(P＜0.01)。
　　 (4)采用Hoechst33258染色法在熒光顯微鏡下觀察藥物干預(yù)后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化:各組細(xì)胞經(jīng)DNA熒光染料Hoechst33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。結(jié)果顯示，正常細(xì)胞核內(nèi)DNA分布相對均勻，核無固縮，在視野中呈現(xiàn)體積較大的

11、淺染核形態(tài)，而凋亡細(xì)胞核內(nèi)DNA濃聚，核出現(xiàn)不同程度的固縮，在視野中呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染的深染核形態(tài)，有細(xì)胞凋亡的典型特征?？瞻讓φ战M細(xì)胞很少有凋亡;塞來昔布組和替莫唑胺組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多;聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡更加顯著。
　　 (5)劃痕實(shí)驗(yàn)觀察藥物干預(yù)后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞遷移能力變化:倒置相差顯微鏡下觀察劃痕處的細(xì)胞生長情況并拍照，通過對比同一空間位置不同時間拍下的照片得到細(xì)胞遷移的數(shù)據(jù)，以劃痕寬度變化表示

12、細(xì)胞遷移能力的大小，劃痕寬度變化愈大，則表示細(xì)胞遷移能力愈強(qiáng)。結(jié)果顯示，各組細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，與空白對照組相比，各藥物干預(yù)組細(xì)胞遷移能力明顯減弱;與塞來昔布組和替莫唑胺組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移能力減弱更加明顯。
　　 3、塞來昔布聯(lián)合替莫唑胺對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞作用可能機(jī)制的研究
　　 Western Blot法檢測藥物干預(yù)后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá)情況:以A值（標(biāo)本灰度值/內(nèi)參灰

13、度值）表示蛋白表達(dá)水平，通過WesternBlot法檢測發(fā)現(xiàn):Bax在空白對照組、塞來昔布組、替莫唑胺組、聯(lián)合用藥組中的A值分別為0.88±0.45、0.96±0.43、1.17±0.39、1.54±0.47，與對照組比較，塞來昔布組Bax的表達(dá)水平增高(P＜0.05)，替莫唑胺組和聯(lián)合用藥組Bax的表達(dá)水平明顯高于對照組(P＜0.01)，聯(lián)合用藥組Bax的表達(dá)水平顯著高于塞來昔布組和替莫唑胺組(P＜0.01); Bcl-2在空白對照組

14、、塞來昔布組、替莫唑胺組、聯(lián)合用藥組中的A值分別為:0.55±0.0.47、0.47±0.31、0.43±0.22、0.37±0.0.22，塞來昔布組、替莫唑胺組及聯(lián)合用藥組Bcl-2的表達(dá)水平明顯低于對照組(P＜0.01)，聯(lián)合用藥組Bcl-2的表達(dá)水平低于塞來昔布組(P＜0.01)，也顯著低于替莫唑胺組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、COX-2在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251細(xì)胞中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài);