hMAM基因啟動(dòng)子與增強(qiáng)子調(diào)控自殺基因HSV-TK靶向殺傷乳腺癌細(xì)胞.pdf

1、目的：①構(gòu)建hMAM基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列調(diào)控報(bào)告基因EGFP的重組腺病毒。②構(gòu)建hMAM基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列調(diào)控自殺基因HSV-TK的重組腺病毒。③驗(yàn)證hMAM啟動(dòng)子和增強(qiáng)子調(diào)控機(jī)制的乳腺癌細(xì)胞特異性。④探討hMAM啟動(dòng)子和增強(qiáng)子調(diào)控自殺基因HSV-TK靶向治療乳腺癌的方法。
　　 方法：⑴根據(jù)Genebank提供的序列合成hMAM啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(EP)DNA并構(gòu)建至質(zhì)粒載體pMD19-T simple。⑵分別將報(bào)告基因EG

2、FP和自殺基因HSV-TK構(gòu)建于EP序列下游，獲得含目的基因EP-EGFP和EP-TK的兩種重組質(zhì)粒pMD19-T-EP-EGFP和pMD19-T-EP-TK。⑶分別將目的基因轉(zhuǎn)移到腺病毒骨架粘粒載體pAxcwit2并包裝獲得兩種重組腺病毒粘粒pAxcwit2-EP-EGFP和pAxcwit2-EP-TK。⑷重組粘粒線性化并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝獲得重組腺病毒Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK。⑸將含重組腺病毒Ad-EP-EGF

3、P分別感染體外培養(yǎng)的各細(xì)胞株：表達(dá)hMAM的乳腺癌細(xì)胞T-47D、不表達(dá)hMAM的乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30和鼻咽癌細(xì)胞5-8F。熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因GFP表達(dá)情況，驗(yàn)證hMAM基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子基因表達(dá)調(diào)控作用的乳腺癌細(xì)胞特異性。⑹分別將重組腺病毒載體Ad-EP-EGFP和Ad-EP-TK感染體外培養(yǎng)的各細(xì)胞株：表達(dá)hMAM的乳腺癌細(xì)胞T-47D、不表達(dá)hMAM的乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30和鼻咽癌細(xì)胞5-8F，并予前藥更昔洛韋治療

4、。另設(shè)不予病毒感染的上述三種細(xì)胞予同樣濃度前藥為對(duì)照組。觀察hMAM基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列調(diào)控自殺基因HSV-TK對(duì)乳腺癌細(xì)胞的靶向殺傷作用。
　　 結(jié)果：①酶切、測(cè)序、轉(zhuǎn)染等驗(yàn)證，兩種重組腺病毒構(gòu)建成功。②熒光顯微鏡下顯示，重組腺病毒Ad-EP-EGFP感染后，在不表達(dá)hMAM的乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30和鼻咽癌細(xì)胞5-8F中無(wú)GFP表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞T-47D中有表達(dá)。③hMAM基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列調(diào)控的自殺基因HSV-TK