PSMA增強子-啟動子驅動shRNA靶向干擾核干因子治療前列腺癌的研究.pdf

1、本文就PSMA增強子/啟動子驅動shRNA靶向干擾核干因子治療前列腺癌進行了研究，主要從以下幾個部方展開： 第一部分靶向干擾EGFP的shRNA質粒表達載體的構建和鑒定 目的：采用不同終止信號構建前列腺特異性膜抗原增強子/啟動子(PSMAe/p)調控的靶向EGFP的shRNA真核表達重組質粒pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)，pPSMAe/p-shEGFP-minipoly(A)和pPSMAe/p-shEGF

2、P-poly(U)。方法：分別使用pSilencerTM4.1-CMVneo質粒中RNA聚合酶II啟動子的終止信號poly(A)，minipoly(A)(AAUAAA六聚體)，RNA聚合酶III啟動子終止信號poly(U)(TTTTTT)為終止信號，采用分子克隆技術將人工合成的含靶向EGFP的shRNA(EGFP-shRNA)及終止信號序列的DNA片段定向克隆入SalI、BamH雙酶切的含有PSMA增強子/啟動子基因序列的質粒載體pPS

3、MAe/p上。重組質粒經菌液PCR、限制性內切酶酶切和測序進行鑒定。結果：通過菌液PCR，質粒酶切和測序鑒定，人工合成的DNA序列成功插入載體pPSMAe/p上，插入目的基因的真核表達載體的酶切圖譜和測序結果與預期一致。結論：成功構建了采用不同終止信號，以前列腺特異性膜抗原增強子/啟動子驅動的靶向干擾EGFP的shRNA真核質粒表達載體pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)，pPSMAe/p-shEGFP-minipoly(A)

4、pPSMAe/p-shEGFP-poly(U)。 第二部分PSMAe/p驅動shRNA靶向干擾EGFP的細胞特異性研究 目的：探討前列腺特異性膜抗原增強子、啟動子(PSMAe/p)驅動shRNA轉錄效果和細胞特異性，比較何種終止序列更有效。方法：通過脂質體LipofectamineTM2000介導，將各重組干擾質粒與pEGFP-C1質粒共轉染高表達PSMA的人前列腺癌細胞系LNCaP、不表達PSMA的人前列腺癌細胞系PC

5、-3、不表達PSMA的人膀胱癌細胞系EJ和人胚腎HEK293細胞，采用熒光顯微鏡，流式細胞儀，半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Westernblot檢測EGFP在各組細胞中的干擾效果。結果：熒光顯微鏡和流式細胞儀測定結果顯示：各干擾質粒與pEGFP-C1質粒共轉染LNCaP后，各干擾組熒光表達均有不同程度減少，與空載體組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)組減少與pPSMAe/p-

6、shEGFP-minipoly(A)組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，和pPSMAe/p-shEGFP-poly(U)組相比有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。各干擾載體與pEGFP-C1質粒共轉染PC-3、EJ和HEK293細胞后各組熒光表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，EGFPmRNA和蛋白表達水平無明顯差異；LNCaP細胞各干擾組中EGFPmRNA和蛋白表達與對照組相比均有不同程度下降，以pPSMAe/p-shEGFP-poly(

7、A)組最為明顯。結論：PSMAe/p能在高表達PSMA的LNCaP細胞中特異性驅動shRNA轉錄，而在不表達PSMA的PC-3細胞、EJ細胞和HEK293細胞中未能有效驅動shRNA轉錄；在三種終止信號中poly(A)信號終止轉錄最有效。 第三部分PSMAe/p驅動shRNA靶向干擾核干因子治療前列腺癌的研究 目的：進一步探討PSMAe/p驅動shRNA靶向干擾NS基因的細胞特異性；通過RNA干擾觀察NS基因沉默對前列腺

8、癌細胞和裸鼠移植瘤生長的影響，探討NS基因與前列腺癌惡性增殖的關系，為前列腺癌的基因治療探索新的靶基因和靶向策略。方法：免疫組化檢測人前列腺癌細胞系LNCaP和PC-3中NS表達；合成以poly(A)為終止信號的針對NS基因的shRNA對應模版的DNA序列，定向克隆入SalI、BamHI雙酶切的pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)的載體中，構建重組質粒pPSMAe/p-shNS-poly(A)。脂質體Lipofectamine

9、TM2000介導重組質粒轉染入人前列腺癌LNCaP和PC-3細胞系中。采用半定量RT-PCR和Westernblot技術檢測干擾后NSmRNA和蛋白水平表達的變化，應用細胞計數檢測細胞增殖情況，應用流式細胞儀檢測細胞周期、細胞凋亡變化情況。以LNCaP細胞構建裸鼠前列腺癌移植瘤模型，腫瘤局部多點注射重組干擾質粒，觀測治療過程中腫瘤體積和測量最終重量，免疫組織化學染色法觀察各組中NS蛋白表達情況。結果：前列腺癌細胞系LNCaP和PC-3中

10、均表達NS蛋白；經過酶切及測序鑒定成功構建重組質粒pPSMAe/p-shNS-poly(A)。在LNCaP細胞中NS基因表達水平下調，細胞增大，胞膜邊緣突起增多，更趨向于分化；S期細胞的百分率降低，G1期的百分率升高；細胞的體外增殖速率明顯降低，細胞凋亡增多。在PC-3細胞中NS基因表達無明顯下調，細胞周期和增殖能力無明顯變化。LNCaP細胞移植瘤生長速度、腫瘤體積和最終重量也明顯降低。結論：PSMAe/p驅動shRNA靶向干擾NS基因