UTMD聯(lián)合納米粒及HTERT-CMV啟動子靶向沉默HSP70治療前列腺癌的研究.pdf

1、雄激素非依賴性前列腺癌(HRPC)的治療是目前公認(rèn)的難題，腫瘤的基因治療是醫(yī)學(xué)界研究的熱點，選擇合適的靶基因及安全有效的基因轉(zhuǎn)染途徑是基因治療成功的關(guān)鍵。
　　HSP70在多種惡性腫瘤細(xì)胞中優(yōu)先大量地表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞抗凋亡及熱療甚至放化療耐受性等許多惡性行為密切相關(guān)，HSP70在前列腺癌細(xì)胞中尤其是雄激素非依賴性的癌細(xì)胞中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，若阻斷癌細(xì)胞內(nèi)HSP70的合成，腫瘤細(xì)胞不能維持其正常代謝，發(fā)生生長抑制或凋亡。85％以上的原

2、發(fā)性腫瘤中端粒酶呈陽性，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(HTERT)啟動子調(diào)控的下游基因可選擇性地在端粒酶陽性的惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，具有明顯的腫瘤靶向性。本研究以HSP70為靶點設(shè)計構(gòu)建含有腫瘤特異性啟動子HTERT核心序列及短發(fā)夾狀RNA(ShRNA)的psilencer4.1質(zhì)粒表達(dá)載體，并以前列腺癌細(xì)胞22RV1為靶細(xì)胞，在基因水平上沉默下調(diào)HSP70的表達(dá)，削弱HSP70為腫瘤細(xì)胞提供的生存優(yōu)勢，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。
　　本實驗采用多聚物納米

3、粒Xfect Polymer（購自Clontech生物公司）將目的質(zhì)粒包裹，在超聲靶向微泡破壞(UTMD)激發(fā)的聲孔效應(yīng)(sonoporation)下，攜載目的質(zhì)粒的納米粒成功轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞，這種納米粒既能有效保護(hù)質(zhì)粒DNA在體內(nèi)轉(zhuǎn)運過程中免受核酸酶降解，又增加了細(xì)胞膜的流動性，為細(xì)胞膜臨時性微孔的開放與修復(fù)封閉提供了便利條件。
　　本研究主要分為三個部分:
　　第一章：腫瘤特異性質(zhì)粒構(gòu)建及功能驗證
　　目的:設(shè)計構(gòu)建含有

4、目的片段的質(zhì)粒psilencer4.1-EGFP-HTERT/CMV-HSP70-ShRNA，同時構(gòu)建psilencer4.1-CMV-HSP70-ShRNA-EGFP，psilencer4.1-HTERT/CMV-EGFP為對照質(zhì)粒，并驗證目的質(zhì)粒的功能，為后期轉(zhuǎn)染實驗準(zhǔn)備材料。
　　方法:分別選用雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞22RV(1)及正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1驗證構(gòu)建的質(zhì)粒載體，采用脂質(zhì)體lipo2000對2種細(xì)胞分別

5、進(jìn)行了3種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染實驗，熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)初步評估轉(zhuǎn)染情況，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率，realtime-PCR技術(shù)檢測HSP70-ShRNA的干擾效果。
　　結(jié)果:端粒酶高活性的前列腺癌細(xì)胞22RV(1)的目的質(zhì)粒平均轉(zhuǎn)染率(14.92±0.70％)明顯高于正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1(4.6±0.71％)，而由CMV啟動子驅(qū)動的對照質(zhì)粒在RWPE-1的轉(zhuǎn)染率(12.2±0.73％)高于22RV(1)(8.92％±1.12

6、％);realtime-PCR技術(shù)顯示實驗組HSP70-mRNA的表達(dá)量約為PBS組的51.2±1.71％，顯示出HSP70-ShRNA的干擾功能。
　　結(jié)論:本實驗構(gòu)建的目的質(zhì)粒載體顯示出HTERT啟動子的腫瘤特異性及HSP70-ShRNA的干擾功能，該質(zhì)粒可以用于后期轉(zhuǎn)染實驗。
　　第二章：UTMD聯(lián)合多聚物納米粒促進(jìn)目的質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞的研究
　　目的:借助UTMD聯(lián)合多聚物納米粒XfectPolymer

7、進(jìn)行體外基因轉(zhuǎn)染實驗，通過檢測轉(zhuǎn)染率及HSP70-ShRNA的干擾效果評估UTMD等多種技術(shù)聯(lián)合促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的可行性。
　　方法:體外實驗按照1×105/孔接種前列腺癌細(xì)胞22RV1于24孔板，篩選優(yōu)化條件后分組處理，以PBS組，plasmid組，UTMD+plasmid組，XfectPolymer+plasmid組為對照組，以UTMD+XfectPolymer+plasmid組為實驗組進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染后48小時，通過

8、流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率及細(xì)胞凋亡率，并通過western-blot及reatime-PCR技術(shù)檢測HSP70-ShRNA的干擾效果;采用transwell及細(xì)胞劃痕實驗檢測腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力的變化，并通過CCK-8細(xì)胞毒性實驗及細(xì)胞平板克隆實驗檢測該技術(shù)對細(xì)胞近遠(yuǎn)期活性的影響。
　　結(jié)果:本實驗采用UTMD聯(lián)合低劑量的XfectPolymer共同促進(jìn)目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，實驗組轉(zhuǎn)染率及凋亡率最高，約為XfectPolymer+piasm

9、id組的2倍，分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)檢測結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞HSP70基因表達(dá)下降，其侵襲及遷移能力明顯減弱，而CCK8細(xì)胞毒性實驗及細(xì)胞平板克隆實驗中，實驗組與對照組沒有明顯差異，顯示了該技術(shù)的安全性。
　　結(jié)論:UTMD聯(lián)合XfectPolymer及HTERT特異性啟動子共同沉默HSP70表達(dá)，明顯誘導(dǎo)了體外前列腺癌細(xì)胞凋亡，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長及遷移侵襲，該實驗可望為惡性腫瘤基因治療提供實驗基礎(chǔ)。
　　第三章：UTMD聯(lián)合多聚

10、物納米粒促進(jìn)目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌移植瘤的實驗研究
　　目的:UTMD聯(lián)合多聚物納米粒XfectPolymer介導(dǎo)目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染移植瘤，通過檢測靶基因分子水平改變、腫瘤超微結(jié)構(gòu)及血供情況的變化等評估體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染效果，評價該基因傳遞方法促進(jìn)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的可行性。
　　方法:將22RV1細(xì)胞皮下接種35只雌性BALB/c裸鼠建模，腫瘤體積約為50-60mm3時分組研究，分組與體外實驗一致，電鏡觀察轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，并對腫

11、瘤組織進(jìn)行了HSP70及caspase3免疫組化研究，實驗處理前及實驗處理后2周對腫瘤血液灌注的改變進(jìn)行超聲造影分析評估。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染實驗后72h，電鏡結(jié)果顯示與對照組相比，實驗組腫瘤組織內(nèi)有更多的細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞膜固縮，核染色質(zhì)凝聚及邊移等凋亡現(xiàn)象，而caspase3的高表達(dá)顯示有效沉默HSP70的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡;轉(zhuǎn)染實驗后2周實體腫瘤造影分析顯示實驗組腫瘤微循環(huán)灌注不佳，其生長受到了有效抑制。
　　結(jié)論:重