前列腺特異性膜抗原啟動(dòng)子-增強(qiáng)子靶向調(diào)控UPRT-5-FU自殺基因系統(tǒng)對(duì)前列腺癌作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 本研究通過構(gòu)建前列腺特異性膜抗原(PSMA)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子靶向性調(diào)控的尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(UPRT)基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒(pPSMApromoter/enhancer-UPRT)，探索pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU自殺基因系統(tǒng)對(duì)前列腺癌特異的靶向殺傷作用。 方法①首先采用PCR技術(shù)，從前列腺癌細(xì)胞株LNCaP的總DNA中擴(kuò)增PSMA啟動(dòng)子和增強(qiáng)子基因序列，分子克隆技術(shù)將PSMA啟動(dòng)子增強(qiáng)

2、子基因序列定向插入報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒載體(pEGFP-1)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPSMApromoter/enhancer-EGFP。應(yīng)用PCR技術(shù)從大腸桿菌JM109基因組中擴(kuò)增UPRT基因序列，同樣通過分子克隆技術(shù)將pPSMApromoter/enhancer-EGFP酶切去除EGFP，連接上UPRT基因，構(gòu)建PSMA啟動(dòng)子增強(qiáng)子靶向性調(diào)控的UPRT基因真核表達(dá)質(zhì)粒pPSMApromoter/enhancer-UPRT。②免疫組化技術(shù)檢測(cè)P

3、SMA在前列腺癌細(xì)胞株和非前列腺癌細(xì)胞株等不同細(xì)胞株的表達(dá)。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pPSMApromoter/enhancerEGFP進(jìn)入前列腺癌細(xì)胞株和非前列腺癌細(xì)胞株等，通過熒光表達(dá)來觀察PSMApromoter/enhancer在細(xì)胞中靶向調(diào)控作用。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pPSMApromoter/enhancer-UPRT和pPSMApromoter/enhancer-EGFP的LNCaP細(xì)胞株，加入G418，篩選出穩(wěn)定表達(dá)UPRT基因和

4、EGFP的細(xì)胞株。③MTT法檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU基因系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的生存率變化；FCM檢測(cè)pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU基因系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞增殖周期的改變，并進(jìn)行細(xì)胞凋亡和壞死的測(cè)定；5-FU在UPRT催化下直接合成FdUMP和FUTP(F-RNA)，利用HPLC測(cè)定細(xì)胞外5-FU的含量變化，證明UPRT的功能。④不同比例的轉(zhuǎn)染細(xì)胞和非轉(zhuǎn)染細(xì)

5、胞混合培養(yǎng)，觀察pPSMApromoter/enhancer-UPRT/5-FU基因系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的旁觀者效應(yīng)。 結(jié)果①成功構(gòu)建重組質(zhì)粒前列腺特異性膜抗原啟動(dòng)子/增強(qiáng)子靶向性調(diào)控的pPSMApromoter/enhancer-EGFP；成功構(gòu)建前列腺特異性膜抗原啟動(dòng)子/增強(qiáng)子靶向性調(diào)控的UPRT基因真核表達(dá)質(zhì)粒pPSMApromoter/enhancer-UPRT，通過測(cè)序鑒定，基因序列正確、無缺失和突變。②應(yīng)用免疫組化技術(shù)

6、對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行PSMA表達(dá)檢測(cè)，僅有前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞株LNCaP的PSMA表達(dá)陽性。同時(shí)，對(duì)這幾種細(xì)胞株轉(zhuǎn)染靶向性調(diào)控的pPSMApromoter/enhancer-EGFP，同樣僅有表達(dá)PSMA的LNCaP有熒光表達(dá)，說明PSMA啟動(dòng)子/增強(qiáng)子對(duì)前列腺癌的靶向特異性。③體外表達(dá)MTT檢測(cè)UPRT/5-FU自殺基因系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞存活率影響，直接用藥和轉(zhuǎn)染UPRT基因后加入藥物均使前列腺癌細(xì)胞株LNCaP存活率下降，后者下降要明顯，計(jì)

7、算IC50，單用5-FU組為UPRT/5-FU系統(tǒng)組的5.5倍。UPRT/5-FU自殺基因系統(tǒng)作用細(xì)胞的抑制殺傷效能增強(qiáng)。④FCM檢測(cè)UPRT/5-FU系統(tǒng)作用引起的細(xì)胞凋亡顯示：正常細(xì)胞組凋亡率為5％，5-FU組為26％～28％，UPRT/5-FU系統(tǒng)組為40％～52％，三組進(jìn)行兩兩比較，p均＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且，隨著5-FU濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率也增大。細(xì)胞增殖周期的檢測(cè)結(jié)果示，LNCaP細(xì)胞的G1期明顯升高，S期細(xì)

8、胞所占比例下降，推斷藥物5-FU是影響細(xì)胞G1向S期的轉(zhuǎn)變，來干擾DNA合成。⑤利用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定UPRT/5-FU系統(tǒng)作用后細(xì)胞外5-FU濃度變化，測(cè)得加入藥物2h后，轉(zhuǎn)UPRT基因組5-FU濃度下降快于單用5-FU組，隨后各組逐漸下降。⑥轉(zhuǎn)染細(xì)胞和非轉(zhuǎn)染細(xì)胞按照不同比例混合，觀察UPRT/5-FU系統(tǒng)旁觀者效應(yīng)(BE)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果該自殺基因系統(tǒng)并沒有明顯的旁觀者效應(yīng)，隨著轉(zhuǎn)染比例的增多，細(xì)胞抑制率也逐漸增加，沒有出現(xiàn)明顯