Survivin靶向的細胞凋亡和基因沉默在前列腺癌治療中的應用.pdf

1、前列腺癌是老年男性生殖系常見的惡性腫瘤。在國外，前列腺癌為男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，死亡率僅次于肺癌，位居第二。我國前列腺癌發(fā)病率呈明顯上升的趨勢，己列居泌尿系腫瘤的第三位，前列腺癌已成為嚴重危害男性健康和生命的主要疾病。傳統(tǒng)的前列腺癌治療手段包括手術、激素治療、化療放療等方法。由于前列腺癌的發(fā)病隱匿性及晚期對激素的非依賴性，目前尚無有效的手術和激素治療手段。消除雄激素非依賴性癌細胞是前列腺癌治愈的關鍵，尋求以激素非依賴性細胞為靶標的前

2、列腺癌治療手段一直是人們努力的方向?；?、放療等手段缺乏對靶細胞選擇的高特異性，全身毒副作用大，極大地限制了其臨床應用。因此，如何有效地克服傳統(tǒng)化療藥物的全身毒性，增強其殺滅前列腺癌細胞的特異性，是擺在各國學者面前的迫切難題。 隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展以及人們對前列腺癌分子發(fā)病機理認識的深入，前列腺癌基因治療也取得了很大進步，目前主要的策略包括：促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡；提高機體對腫瘤細胞的免疫反應；誘導腫瘤細胞產(chǎn)生“自殺效應”

3、。而基因治療存在著治療基因的表達靶向性差及治療基因轉(zhuǎn)運效率低等缺點，用組織特異性啟動子調(diào)控治療基因使之在特定的組織中靶向性表達是提高基因治療靶向性的有效手段，適用范圍廣。Survivin 是一種具有腫瘤特異性表達的細胞凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein，IAP)中的新成員，主要表達于細胞G2/M 期，survivin 在細胞中的生理功能涉及到細胞周期的調(diào)控、細胞凋亡和腫瘤中血管

4、的生成等，它表達于幾乎所有人類腫瘤組織中，但極少見于正常組織。鑒于survivin 在細胞凋亡中起到的重要作用，近年來已成為腫瘤基因治療的重要靶點使其有可能成為腫瘤基因治療理想的新靶點。目前，常用的腫瘤組織特異性啟動子survivin 已證實在大多數(shù)腫瘤細胞中表達，而在正常組織中不表達。 Caspases 是一類在細胞凋亡中起關鍵作用的蛋白酶家族，其中caspase-3在凋亡的信息傳遞中居于核心地位。目前將caspases 應用

5、于腫瘤基因治療的所采取的策略包括： ①促進caspases 的過量表達，尤其是caspase-3、6、7 等效應caspase 分子的過表達。 ②直接導入活性caspase 分子。應用caspases 作為效應分子為人們提供了一種基因治療的新思路。 RNA 干涉是雙鏈RNA 介導的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。當前，RNAi 已發(fā)展成為一種高效的實驗工具，用于高效特異地關閉或降低特定基因的表達，顯示了非常廣闊的

6、應用前景。microRNAs 是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一類新型的小分子RNAs，在高等生物的正常發(fā)育中起著舉足輕重作用，其表達和功能的異常變化會在包括腫瘤在內(nèi)的重大疾病中起著重要作用本研究首先針對survivin 啟動子序列設計引物，PCR 獲得兩條啟動子S26830 和S2681 序列，將它們插入pGL3-Basic 載體和pPRIME 載體，構成熒光素酶和GFP 重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞PC-3、LNCap、宮頸癌細胞Hela 和永生化

7、細胞Chang liver，觀察其熒光素酶活性和GFP 的表達，比較這兩段啟動子活性。結(jié)果顯示：S26830 和S2681 在三種腫瘤細胞中熒光素酶和GFP 均有較高表達，約為CMV 活性的三分之一。而在正常Chang liver 細胞中幾乎不表達，說明survivin 啟動子具有腫瘤特異性。且S26830 的活性較S2681 的強，各細胞表達不同，S2681 約為S26830 的20％～40％。故我們選用S26830 做下一步試驗。

8、 隨后，我們用microRNA 表達載體pPRIME 構建了針對survivin 基因的microRNA 表達載體。即根據(jù)microRNA 設計原則設計并合成了3 條針對survivin 的microRNA 片段，通過PCR 在兩端添加酶切位點，克隆入pPRIME載體，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染非雄激素依賴前列腺癌細胞系PC-3，運用免疫印跡和RT-PCR 技術觀察三個microRNA 對PC-3 細胞中survivin 的表達變化。MTT法

9、檢測survivin 基因沉默后PC-3 的細胞生長影響。 結(jié)果表明： pPRIME-SV1和pPRIME-SV2 重組載體均有效地阻斷了PC-3 細胞中survivin 基因的表達。與對照組相比，survivin 基因在mRNA 和蛋白水平上的表達明顯下調(diào)，并且轉(zhuǎn)染PC-3 細胞后，細胞生長速度明顯變慢，其細胞數(shù)在84h 時與對照組相比減少約40％。 最后，為了進一步觀察腫瘤特異性啟動子的靶向作用，同時增加凋亡分子對前

10、列腺癌細胞PC-3 的影響，我們選取前面抑制效果較好的pPRIME-SV2重組質(zhì)粒，將第一部分鑒定活性較強的survivin 啟動子片段S26830 替換掉pPRIME-SV2 重組質(zhì)粒中的CMV 啟動子，同時將具有活性的Caspase-3 分子替換了載體中的GFP 片段，構成了一系列重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3 細胞，通過流式細胞術和電鏡觀察其細胞凋亡和細胞內(nèi)結(jié)構及對化療藥物的敏感性等方面的變化。流式細胞術結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒添加活性c

11、aspase-3 后，其細胞凋亡數(shù)比沒有caspase-3 的重組質(zhì)粒明顯增加，且對化療藥物的敏感性進一步增強。Survivin 啟動子調(diào)控的重組質(zhì)粒較CMV 啟動子促細胞凋亡能力弱。電鏡觀察細胞結(jié)構和細胞器變化也顯示核固縮、染色質(zhì)濃縮和凋亡小體形成等典型凋亡細胞特征。 本研究基于survivin 的腫瘤組織特異性，構建由survivin 調(diào)控的凋亡分子和microRNA 表達載體，觀察其在前列腺癌細胞PC-3 中的殺傷作用，實