Bmi-1啟動子介導(dǎo)Bmi-1干擾靶向性治療胃癌研究.pdf

1、第一部分Bmi-1在調(diào)控胃癌干細胞及化療藥物敏感性中的作用
　　 背景：腫瘤干細胞理論的提出為目前腫瘤的不可治愈性、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移等特性提供了很好的解釋，越來越多的研究證實腫瘤干細胞的存在。腫瘤干細胞是腫瘤中一小部分具有干細胞性質(zhì)的細胞群體，具有自我更新的能力，是形成不同分化程度的腫瘤細胞和腫瘤不斷擴大的源泉。腫瘤干細胞雖占腫瘤細胞的比重很低，但由于其處于靜止期且常高表達耐藥相關(guān)基因，表現(xiàn)為化、放療抵抗，同時其具有的高轉(zhuǎn)移能力，亦成

2、為腫瘤治療失敗、復(fù)發(fā)的根源。腫瘤干細胞研究已成為目前腫瘤研究的熱點。目前已成功分離乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤干細胞，但胃癌干細胞的研究報道較少，目前發(fā)現(xiàn)CD44+處于靜息或較低的增殖狀態(tài)細胞可能是體內(nèi)胃癌細胞的來源，CD44+胃癌細胞具有類干細胞特性，表現(xiàn)為較高的成瘤性和化、放療抵抗。亦有報道CD133+胃癌細胞具有腫瘤干細胞樣特性。從胃癌中分離的SP(side population)細胞表現(xiàn)較高的腹膜粘附性和轉(zhuǎn)移性，目前對胃

3、癌干細胞的分離方法仍很不成熟，更缺乏靶向腫瘤干細胞的治療方法。Bmi-1在調(diào)節(jié)干細胞與腫瘤細胞的增殖與自我更新中發(fā)揮重要作用；Hedgehog信號傳導(dǎo)通路的過度活化為腫瘤干細胞形成與無限增殖的元兇之一，已有研究表明Bmi-1在Hedgehog信號通路調(diào)控正常乳腺干細胞與乳腺癌干細胞的自我更新中發(fā)揮關(guān)鍵作用?？梢姡珺mi-1可能在腫瘤干細胞特性的維持中發(fā)揮重要作用，可能成為腫瘤干細胞的治療靶點。
　　 方法：無血清培養(yǎng)法、細胞表面

4、標記CD44、CD133流式細胞分選分離胃癌干細胞；從腫瘤干細胞標志物檢測、化療抵抗、高轉(zhuǎn)移性和體內(nèi)成瘤性等四個方面特性鑒定胃癌干細胞；改變Bmi-1表達觀察其對胃癌干細胞特性和對化療藥物敏感性的影響。
　　 結(jié)果：從胃癌細胞株及原代胃癌細胞中分離出微球體具有胃癌干細胞樣特性；CD133(+)或CD44(+)胃癌細胞具有化療抵抗、更高的轉(zhuǎn)移能力和成瘤能力；Bmi-1在維持胃癌干細胞自我更新和化療藥物抵抗中發(fā)揮作用；5-Fu化療藥

5、物可富集胃癌干細胞。
　　 結(jié)論：Bmi-1在維持胃癌干細胞特性及化療耐藥中發(fā)揮作用，干擾其表達后可部分逆轉(zhuǎn)其干細胞特性和提高化療藥物敏感性。
　　 第二部分 Bmi-1啟動子介導(dǎo)Bmi-1基因干擾腺病毒體內(nèi)、外靶向殺傷胃癌作用及機制研究
　　 背景：尋找在腫瘤中特異性表達的靶點、開發(fā)靶向性的RNA干擾(RNAi)載體是當前RNAi治療研究的兩大重要方面；腫瘤干細胞是腫瘤治療失敗的主要原因之一，已成為新的治療靶點

6、。Bmi-1為干細胞與腫瘤細胞的自我更新能力所必需，我們前期工作發(fā)現(xiàn)Bmi-1特異性高表達于胃癌組織，并與胃癌的侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)，具有較好的靶向治療意義。因而，我們設(shè)想構(gòu)建Bmi-1啟動子介導(dǎo)的Bmi-1干擾腺病毒載體，使其特異性地在高水平表達Bmi-1的癌細胞中表達，通過特異性的沉默Bmi-1表達，進而抑制或殺傷胃癌細胞。
　　 方法：采用熒光素酶報告載體檢測Bmi-1啟動子活性，構(gòu)建Bmi-1啟動子介導(dǎo)Bmi-

7、1干擾腺病毒(Ad-Bmi-li)。1)體外細胞實驗：檢測Ad-Bmi-li腺病毒載體對不同Bmi-1表達水平的胃癌細胞Bmi-1沉默效果，及對腫瘤細胞增殖、凋亡、細胞衰老、細胞運動/轉(zhuǎn)移等的影響；Western blot驗證Bmi-1干擾對p53、p16、Erk、Oct4和Akt等傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達水平的影響。2)體內(nèi)實驗：Bmi-1低表達和Bmi-1高表達胃癌細胞感染Ad-Bmi-1腺病毒篩選獲得Bmi-1穩(wěn)定干擾胃癌細胞株，觀察

8、Bmi-1干擾對體內(nèi)成瘤的影響；原位組織β-半乳糖苷酶染色明確體內(nèi)Bmi-1干擾對腫瘤細胞衰老的影響；IHC和Western blot檢測相關(guān)潛在下游靶蛋白表達明確其體內(nèi)的調(diào)控機制。3)基因治療：采用瘤內(nèi)注射方法觀察Ad-Bmi-li腺病毒對不同Bmi-1表達水平胃癌細胞裸鼠皮下移植瘤的殺傷效果；IHC法檢測相關(guān)可能靶基因和干細胞標志物的表達明確Bmi-1體內(nèi)調(diào)控機制及Ad-Bmi-li病毒是否可以殺傷腫瘤干細胞。
　　 結(jié)果：

9、體外感染Ad-Bmi-li病毒可誘導(dǎo)胃癌細胞衰老，明顯抑制胃癌細胞的惡性表型和細胞運動、遷移能力，其抑制效果與細胞自身Bmi-1表達水平呈正相關(guān)。感染Ad-Bmi-li穩(wěn)定干擾Bmi-1后，胃癌細胞體內(nèi)成瘤能力明顯減弱，且Ad-Bmi-li體內(nèi)抑瘤效果與細胞自身Bmi-1表達水平呈正相關(guān)。瘤內(nèi)直接注射Ad-Bmi-li病毒可明顯殺傷胃癌細胞，可能對胃癌干細胞樣細胞亦有殺傷作用。Bmi-1主要通過調(diào)節(jié)Akt、p16及p53通路誘導(dǎo)細胞衰老