siRNA介導(dǎo)的Bmi-1基因沉默對Hela細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：原癌基因Bmi-1屬于PcG家族一員，決定著正常干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力。近年來發(fā)現(xiàn)Bmi-1基因在多種腫瘤細(xì)胞及惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展預(yù)后密切相關(guān)，因而有望成為腫瘤治療中新的基因靶點和輔助診斷的指標(biāo)。本研究根據(jù)Bmi-1基因設(shè)計四條siRNA，把它克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pGensil-2上；選擇人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞作為研究對象，通過轉(zhuǎn)染Bmi-1 siRNA表達(dá)載體進(jìn)入Hela細(xì)胞來沉默Bmi-1基因的

2、表達(dá)，以觀察其對Hela細(xì)胞生物學(xué)行為的影響并探討其機(jī)制。 方法：1、根據(jù)GENEBANK中的．Bmi-1 mRNA Sequence NM_005180，設(shè)計四條Bmi-1 siRNA序列和一條隨機(jī)序列的陰性對照，應(yīng)用NCBI的網(wǎng)上比對工具BLAST進(jìn)行查詢，確認(rèn)所設(shè)計siRNA序列的唯一性。將所選擇的片段呈反向互補(bǔ)加到莖環(huán)序列的兩端，加上酶切位點后插入pGenesil-2質(zhì)粒，構(gòu)建了表達(dá)Bmi-1 siRNA的重組真核表達(dá)載

3、體。2、采用脂質(zhì)體法將Bmi-1 siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入Hela細(xì)胞，通過檢測Hela細(xì)胞中Neo基因的表達(dá)，來確定質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，并利用熒光法觀察轉(zhuǎn)染效率。3、應(yīng)用RT-PCR及Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后Bmi-1mRNA及Bmi-1蛋白的表達(dá)情況。4、應(yīng)用MTT比色法、臺盼藍(lán)拒染法檢測Bmi-1 siRNA對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用。5、利用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。6、平板克隆形成實驗檢測B

4、mi-1 siRNA對Hela細(xì)胞的單細(xì)胞增殖能力的影響。7、在裸鼠腋窩將各組細(xì)胞進(jìn)行皮下接種，觀察在裸鼠體內(nèi)Bmi-1 siRNA對Hela細(xì)胞致瘤能力的影響。8、應(yīng)用Transwell實驗檢測Bmi-1 siRNA對Hela細(xì)胞體外遷移的影響。9、將各組細(xì)胞從尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，觀察在裸鼠體內(nèi)Bmi-1 siRNA對Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。 結(jié)果：1、成功的構(gòu)建了四條表達(dá)Bmi-1 siRNA的重組質(zhì)粒和一條陰性對照重

5、組質(zhì)粒。2、轉(zhuǎn)染后觀察熒光和Neo基因的表達(dá)情況證實重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入了Hela細(xì)胞中且轉(zhuǎn)染效率在90%左右。3、RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示：各組Bmi-1 siRNA均能沉默Hela細(xì)胞中Bmi-1mRNA及Bmi-1蛋白的表達(dá)。4、MTT及流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：Bmi-1siRNA在體外能夠抑制Hela細(xì)胞的增殖；細(xì)胞周期阻滯于G0-G1期，使細(xì)胞增殖指數(shù)明顯下降。5、克隆形成實驗表明Bmi-1 siRNA明顯抑

6、制了Hela細(xì)胞的單細(xì)胞增殖能力。6、體內(nèi)成瘤實驗顯示Bmi-1 siRNA使Hela細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤能力明顯下降。7、Bmi-1 siRNA在體外能夠抑制Hela細(xì)胞穿過transwell小室的能力即遷移能力。8、Bmi-1 siRNA在裸鼠體內(nèi)能夠抑制Hela細(xì)胞的血道轉(zhuǎn)移能力。 結(jié)論：siRNA介導(dǎo)的Bmi-1基因的表達(dá)沉默，在體外抑制了Hela細(xì)胞的增殖和遷移能力，在裸鼠體內(nèi)抑制了Hela細(xì)胞的致瘤及轉(zhuǎn)移能力。Bmi