慢病毒介導的Bmi-1基因沉默對骨髓瘤細胞生物學特性及硼替佐米敏感性影響的研究.pdf

1、目的：構建Bmi-1 shRNA慢病毒表達載體以沉默Bmi-1基因的表達，建立穩(wěn)定干擾Bmi-1基因的骨髓瘤細胞株；研究Bmi-1基因沉默對骨髓瘤細胞株U266和RPMI8226生物學特性及對硼替佐米敏感性的影響及其機制。
　　方法：設計合成一對針對Bmi-1 mRNA的shRNA序列，利用分子克隆技術構建慢病毒表達載體—pLVTHM-shBmi-1，空載體作為對照組，分別與包裝載體psPAX2及PMD2.G共轉染HEK293T細

2、胞，包裝出高滴度的病毒顆粒；感染骨髓瘤細胞株U266和RPMI8226，經過流式細胞儀分選獲得穩(wěn)定細胞株。接著應用real-timePCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測Bmi-1及p14的表達；CCK-8法檢測穩(wěn)定株細胞增殖；克隆形成實驗檢測穩(wěn)定株細胞克隆形成能力；流式細胞術(FCM)檢測穩(wěn)定株細胞周期和凋亡的變化；AO/EB染色、Hoechst33258熒光染色法觀察穩(wěn)定株細胞凋亡形態(tài)；Western blot

3、檢測P21、Bax和Bcl-2蛋白水平改變。進一步，采用CCK-8法、克隆形成法、流式細胞術和熒光染色法分別從細胞增殖、克隆形成、細胞周期和凋亡、Western blot等方面研究Bmi-1基因沉默對骨髓瘤細胞硼替佐米敏感性的影響及其機制。
　　結果：(1)成功構建慢病毒表達載體pLVTHM-shBmi-1。(2)成功建立穩(wěn)定細胞株：real-timePCR和Western blot結果顯示干擾組細胞Bmi-1 mRNA和蛋白水平

4、表達均下調，說明穩(wěn)定干擾Bmi-1的骨髓瘤細胞株成功建立。(3)Bmi-1基因沉默對穩(wěn)定株細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響：○1 CCK-8結果顯示：48～96小時與對照組相比，U266及RPMI8226干擾組細胞增殖抑制率分別為22.83～25.1％和13.9～26.9%；○2克隆形成顯示：Bmi-1基因沉默抑制骨髓瘤細胞的克隆形成能力；○3流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示：U266細胞：對照組和干擾組G1期細胞比率分別為39.91%

5、±0.26%和45.65%±0.68%；RPMI8226細胞：對照組和干擾組G1期細胞比率分別為42.7%±0.47%和50.86%±0.38%；○4流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示：U266細胞：對照組和干擾組的凋亡率分別為9.8%及12.12%，RPMI8226細胞：對照組和干擾組的凋亡率分別為9.6%及15.69%。(4)Bmi-1基因沉默增強骨髓瘤細胞對硼替佐米的敏感性：○1不同濃度的硼替佐米分別處理對照組和干擾組細胞72小時，細

6、胞增殖明顯受抑制，干擾組聯(lián)合用藥作用更明顯，IC50分別為：U266對照組24.73nmol/L，干擾組18.59nmol/L；RPMI8226對照組32.99nmol/L，干擾組21.56nmol/L；○2聯(lián)合40nmol/L硼替佐米處理細胞48小時，干擾組細胞加藥周期阻滯更明顯：U266細胞：對照組和干擾組G1期細胞比率分別為45.35%±0.77%和56.81%±0.50%；RPMI8226細胞：對照組和干擾組G1期細胞比率分別為

7、49.27%±0.90%和56.94%±0.61%；○3聯(lián)合40nmol/L硼替佐米處理細胞48小時，干擾組細胞凋亡率增加：U266細胞：對照組和干擾組的凋亡率分別為20.83%和28.14%，RPMI8226細胞：對照組和干擾組的凋亡率分別為22.5%和49.14%；○4Western blot檢測p21、Bcl-2、Bax蛋白水平結果顯示：干擾組p21、Bax表達上調，而抗凋亡蛋白Bc l-2表達下調，加藥處理后上述改變更明顯。