沉默Musashi1基因對結腸癌細胞生物學特性及放療敏感性的影響.pdf

1、結腸癌是全球范圍內消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國僅次于胃癌和食道癌，位居第三，且近年來發(fā)病率持續(xù)升高，預后差。有關其發(fā)病機制及防治措施的研究是生物醫(yī)學領域研究的熱點之一。
　　結腸癌的發(fā)生是在不同遺傳背景下由致癌基因的激活和抑癌基因的失活共同作用的結果。轉錄后調控是基因表達的關鍵部分，這一過程主要受RNA結合蛋白（RNA-Binding Proteins，RBPs）的調節(jié)。業(yè)已證實，人體基因組中包含有800多種RBPs

2、，其中的幾種被發(fā)現控制著與癌變過程相關的基因網絡。對RBPs深入的研究逐步揭示，它們與轉錄因子類似，具有抑癌和促癌作用。
　　Musashi1（Msi1）作為一種進化保守的RNA結合蛋白家族成員，對于維持自我更新與分化之間的平衡具有重要作用。眾多研究表明， Msi1可作為一種致癌基因，也是多種腫瘤干細胞和(或)祖細胞的重要標記物，能刺激腫瘤干、祖細胞的形成和發(fā)展。過度表達Msi1的腸上皮祖細胞可通過激活Wnt、Notch信號通路及

3、調節(jié)p21這三個作用靶點，使細胞增殖旺盛，促進祖細胞的致瘤性，增加移植瘤的致瘤性。一般認為，腫瘤干細胞對放化療抗拒，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和復發(fā)、轉移的根源。Msi1可能通過促進β-鏈蛋白（β-catenin）的核內聚，增加結腸癌放療的不敏感性，促進侵襲性腫瘤發(fā)展。此外Msi1位于多個信號通路的交匯點，是細胞基因表達的關鍵調節(jié)器，在細胞發(fā)育和內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。同時， Msi1也可作為多種癌變的關鍵調節(jié)劑，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Msi1

4、有望成為防治癌癥的一個分子靶點。
　　因此，確定Msi1在結腸癌中的作用及其機制具有重要的理論意義和潛在的應用價值。但目前有關Msi1對結腸癌細胞的作用及其機制尚不明確。本研究旨在探討Msi1在結腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機制，以及對放療敏感性的影響。本課題研究將分四部分進行。1.首先在結腸癌患者的癌組織和結腸癌細胞系證實 Msi1的高表達，通過 RNA干擾技術構建沉默Msi1穩(wěn)轉細胞系；2.探討沉默Msi1對結腸癌細胞生物學特性

5、的影響；3.探討沉默Msi1對結腸癌細胞生長影響的分子機制；4.探討沉默Msi1對結腸癌細胞放療敏感性的影響。
　　第一部分結腸癌組織和細胞中Musashi1蛋白表達及Musashi1穩(wěn)定低表達結腸癌細胞系構建
　　目的：檢測Musashi1在結腸癌組織和結腸癌細胞系的表達水平；構建Msi1穩(wěn)定低表達結腸癌細胞系。
　　方法：采用Western blot方法檢測結腸癌患者癌組織、癌周正常組織、以及HCT116、SW48

6、0和SW620三種結腸癌細胞系中Msi1的蛋白表達，挑選 Msi1表達水平最高的結腸癌細胞系進行后續(xù)研究。應用 RNA干擾技術設計沉默Msi1的基因序列及陰性對照序列，通過與質粒連接后感染工具細胞，將干擾質粒及陰性對照質粒植入慢病毒載體，隨后感染結腸癌細胞；經過抗生素篩選獲得穩(wěn)定低表達細胞株，并運用Real-time PCR及Western blot的方法從RNA水平和蛋白水平檢測空白組（Blank）、陰性對照組（negative co

7、ntrol，NC）和敲低組（knock down，KD）HCT116結腸癌細胞基因沉默的效果。
　　結果：通過Western blot方法檢測，發(fā)現與正常腸粘膜相比，結腸癌組織及三種結腸癌細胞株中 Msi1蛋白均特異性高表達；在 HCT116、SW480、SW620三種結腸癌細胞株中，HCT116細胞Msi1蛋白的表達量最高，因此選取HCT116細胞作為后續(xù)研究的目的細胞。本研究中，成功構建了帶有干擾Msi1基因序列GV248-M

8、si1-shRNA的慢病毒及陰性對照慢病毒 GV248-NC-shRNA，將干擾慢病毒及陰性對照慢病毒感染結腸癌HCT116細胞，利用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定的表達株。同時 Real-time PCR和 Western blot結果顯示，感染 Msi1干擾慢病毒載體后結腸癌 HCT116細胞Msi1在RNA水平和蛋白水平分別下降了73.85％和59.01%。
　　小結：結腸癌組織及結腸癌細胞株中Msi1蛋白均特異性高表達。利用結腸癌HC

9、T116細胞株可成功構建穩(wěn)定低表達Msi1細胞系。
　　第二部分沉默Musashi1對結腸癌HCT116細胞生物學特性的影響
　　目的：探討沉默Musashi1對結腸癌HCT116細胞生物學特性的影響。
　　方法：利用構建穩(wěn)定低表達Msi1的結腸癌HCT116細胞，應用MTS法檢測沉默Msi1后結腸癌細胞增殖情況，應用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡的變化，Transwell小室檢測其體外侵襲能力，腫瘤球實驗檢測腫瘤細胞干

10、性。并通過建立裸鼠移植瘤模型，觀察沉默Msi1對裸鼠成瘤的影響。
　　結果：MTS法及Transwell小室檢測結果顯示，沉默Msi1后，結腸癌HCT116細胞體外增殖及侵襲能力顯著下降。流式細胞檢測結果顯示，沉默Msi1后腫瘤細胞的凋亡明顯增加，G0/G1期細胞增多。腫瘤球實驗結果顯示，沉默Msi1可明顯降低腫瘤球形成的數量。結腸癌HCT116細胞裸鼠皮下移植瘤結果顯示，降低Msi1表達可明顯抑制移植瘤的生長。
　　小結：

11、沉默Msi1能抑制結腸癌HCT116細胞體外增殖能力和侵襲能力，導致細胞G0/G1期阻滯，誘導細胞凋亡。沉默Msi1可明顯降低結腸癌HCT116細胞的干性，抑制移植瘤的生長。
　　第三部分沉默Musashi1對結腸癌HCT116細胞生長抑制的分子機制
　　目的：探討沉默Musashi1抑制結腸癌HCT116細胞生長的分子機制。
　　方法：利用Real-time PCR和Western blot技術檢測沉默Msi1基因后

12、
　　細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物 p21（抑癌基因） mRNA和蛋白的表達水平，并構建p213?-UTR熒光素酶報告基因載體（p21WT）及其突變體（p21MU），將報告基因載體轉染沉默Msi1的細胞和對照組細胞株，計算 Msi1敲低組細胞與對照組細胞的熒光比值，并進行比較以判斷 p213?-UTR區(qū)活性。
　　結果：Western blot方法檢測發(fā)現，與空白組及陰性對照組相比較，沉默Msi1后結腸癌HCT116細胞的p

13、21蛋白表達明顯上調；Real-time PCR結果顯示，3組細胞p21 mRNA水平的表達未見明顯變化。進一步熒光素酶報告實驗結果顯示，與空白組、陰性對照組相比，敲低組p21WT的熒光素酶活性明顯上升，Msi1反應位點突變體p21MU的熒光素酶活性則沒有明顯變化。
　　小結：結腸癌HCT116細胞中，Msi1能夠與其靶基因p21 mRNA的3?-UTR區(qū)特異性的結合，并抑制其翻譯，下調p21蛋白表達，進而促進腫瘤細胞生長。沉默M

14、si1后可通過上調p21蛋白的表達，發(fā)揮抑制腫瘤生長作用。
　　第四部分沉默Musashi1對結腸癌HCT116細胞放療敏感性的影響
　　目的：探討沉默Musashi1對結腸癌HCT116細胞放療敏感性的影響。
　　方法：采用慢病毒介導的Msi1干擾表達質粒感染HCT116細胞；對感染的HCT116細胞進行X線照射；運用克隆實驗檢測沉默Msi1基因對HCT116細胞放射敏感性的影響。通過 MTS法檢測照射后結腸癌細胞增

15、殖情況，并計算其抑制率。運用流式細胞術檢測照射后細胞周期及凋亡的變化。
　　結果：克隆形成實驗顯示，經0~8Gy X線照射后，敲低組細胞存活曲線下降，D0、Dq、N和 SF2值均明顯低于空白組和陰性對照組，相對于空白組和陰性對照組放射增敏比SER分別為1.56和1.47。MTS試驗結果顯示，各時間段敲低組細胞的增殖活性均顯著低于空白組和陰性對照組，而且隨著時間和劑量的增加，各組抑制率逐漸增加。進一步流式細胞術顯示，照射后各組細胞凋

16、亡率明顯增加，并呈現時間依賴性，隨著時間延長，凋亡率逐漸增加。敲低組凋亡比例在各時間點增加的程度更加明顯。并且照射后敲低組細胞G2/M期比例較空白組和陰性對照組顯著下降。
　　小結：抑制結腸癌HCT116細胞Msi1基因表達具有放療增敏作用，其增敏機制可能是通過促進細胞凋亡，解除放療后細胞G2/M期阻滯，從而增加結腸癌HCT116細胞的放療敏感性。
　　結論:
　　1結腸癌組織及結腸癌細胞株中 Msi1蛋白均特異性高表

17、達，提示Msi1可能在結腸癌發(fā)生與發(fā)展中起重要作用；
　　2利用結腸癌HCT116細胞可成功構建穩(wěn)定低表達Msi1的細胞株；
　　3沉默Msi1可抑制結腸癌HCT116細胞增殖和侵襲能力，導致細胞G0/G1期阻滯，誘導細胞凋亡，降低細胞干性，抑制移植瘤的生長；
　　4沉默Msi1可上調結腸癌HCT116細胞Msi1的靶基因p21蛋白的表達，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用；
　　5沉默Msi1可通過促進結腸癌HCT116細