RNA干擾靶向沉默PAUF基因?qū)Y(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為影響的實驗研究.pdf

1、目的：檢測胰腺腺癌上調(diào)因子（pancreatic adenocarcinoma up-regulated factor，PAUF）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在結(jié)腸癌患者中的表達情況，并通過RNA干擾靶向沉默PAUF表達，觀察其對人結(jié)腸癌細胞HCT116增殖凋亡及侵襲能力的影響，探討PAUF基因在結(jié)腸癌中的作用，為進一步研究結(jié)腸癌的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.收集48例結(jié)腸癌標(biāo)本，每份標(biāo)本同時收取腫瘤組織

2、和癌旁正常組織。分別采用RT-PCR，免疫組化檢測各組織中PAUF和β-catenin的表達水平。培養(yǎng)5株結(jié)直腸癌細胞株，RT-PCR檢測各細胞株中PAUF表達水平，進而篩選出高表達細胞株HCT116以備后續(xù)實驗用。
　　2.以脂質(zhì)體（lipofectamine TM2000）為載體將帶熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染HCT116細胞并用流式細胞儀檢測從而篩選出最佳轉(zhuǎn)染條件。設(shè)計制備針對PAUF基因的3組不同小干擾RNA序列，以最佳轉(zhuǎn)染條

3、件轉(zhuǎn)染細胞后分別采用RT-PCR以及Western法驗證干擾效果并進而篩選出最佳干擾片段以備后續(xù)實驗用。
　　3.將先前篩選出的最佳干擾片段PAUF-siRNA2按最佳轉(zhuǎn)染條件對PAUF高表達細胞株HCT116進行RNA干擾，再分別采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法，流式細胞術(shù)（FCM），侵襲實驗，粘附實驗，遷移實驗檢測RNA沉默PAUF后對結(jié)腸癌HCT116細胞增殖，凋亡、周期及侵襲、粘附、遷移性的影響。
　　結(jié)果：
　

4、　1.癌旁組織中PAUF和β-catenin的表達量明顯低于腫瘤組織(P<0.05)。并且，在腫瘤組織和癌旁組織中PAUF的表達與β-catenin的表達均呈現(xiàn)相關(guān)性(P<0.05)。 PAUF在5株結(jié)直腸癌細胞中均有不同程度的表達，但在HCT116中表達量最高。
　　2.細胞數(shù)約為每孔1.5×105個、siRNA濃度約為80pmol，Lipofectamine2000與siRNA比例為4ul:4ul(6孔板)時，有較佳的轉(zhuǎn)染效率

5、，繼續(xù)提高siRNA濃度并不能明顯提高轉(zhuǎn)染效率。將三組siRNA轉(zhuǎn)染細胞后PAUF表達量均有不同程度下降，其中以PAUF-siRNA2干擾效果最明顯，轉(zhuǎn)染細胞后PAUF和β-catenin的mRNA和蛋白表達明顯下降。
　　3.轉(zhuǎn)染了PAUF-siRNA2的結(jié)腸癌細胞HCT116吸光度值降低，增殖活力下降，生長緩慢，細胞凋亡增加，且大部分停留在G2/M期，同時，細胞的侵襲、粘附及遷移性減低。
　　結(jié)論：PAUF基因在結(jié)腸癌中