RNAi沉默NRP-1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞生物學(xué)行為影響的實驗研究.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶人NRP-1的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)的慢病毒表達(dá)載體并篩選出高效的NRP-1/shRNA干擾序列，初步探討RNAi(RNAinterference，RNAi)沉默NRP-1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞的生物學(xué)行為的影響。
　　方法：1.設(shè)計并合成3對靶向人NRP-1的特異性干擾序列和1對非特異性對照序列，分別亞克隆至慢病毒載體pLB中，通過PCR及測序進(jìn)行鑒定;2.Westernblot技

2、術(shù)鑒定高表達(dá)NRP-1的乳腺癌細(xì)胞株;3.分別將重組質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，生產(chǎn)慢病毒顆粒，并依據(jù)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)水平檢測病毒滴度;慢病毒顆粒感染細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀篩選出GFP陽性細(xì)胞;4.實時熒光定量RT-PCR和Western blot技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平檢測NRP-1的表達(dá)，并篩選出沉默效率最高的干擾序列;5.CCK-8法及AV-PI法結(jié)

3、合流式細(xì)胞儀(FCM)檢測RNA干擾NRP-1基因?qū)?xì)胞增殖、凋亡的影響;6.CCK-8法檢測EPI對MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞的生長抑制情況及AV-pI法結(jié)合流式細(xì)胞儀(FCM)檢測EPI誘導(dǎo)后各組細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：1.經(jīng)PCR及測序結(jié)果證實，成功構(gòu)建了pLB-NRP-1/shRNA重組慢病毒質(zhì)粒，重組慢病毒滴度達(dá)108 IU/mL;2.Western blot結(jié)果顯示:MCF-7及SK-BR-3細(xì)胞高表達(dá)NRP-

4、1蛋白;3.重組慢病毒顆粒感染后，MCF-7細(xì)胞及SK-BR-3細(xì)胞特異性干擾組(pLB-NRP-1/shRNA3) NRP-1 mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯低于對照組;4.CCK-8法結(jié)果顯示:MCF-7細(xì)胞及SK-BR-3細(xì)胞NRP-1/shRNA組于48 h、72 h、96 h的OD值均低于相應(yīng)對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而陰性對照組和空白對照組無明顯差異(P＞0.05);AV-PI法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測凋亡率顯示:M

5、CF-7細(xì)胞及SK-BR-3細(xì)胞NRP-1干擾組的凋亡率均高于相應(yīng)對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而陰性對照組和空白對照無明顯差異(P＞0.05);5.CCK-8法結(jié)果示:EPI在濃度0-10.0μg/mL時，隨濃度的升高，抑制作用增強(qiáng);MCF-7細(xì)胞的IC50為2μg/mL，而SK-BR-3細(xì)胞的IC50為1.5μg/mL; EPI作用于細(xì)胞后，MCF-7細(xì)胞和SK-BR-3細(xì)胞干擾組的凋亡率均較對照組增加(P＜0.05)