GPC5對(duì)人肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:
　　肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，一項(xiàng)多中心的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)位于13q31.3位點(diǎn)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(glypican-5，GPC5)可能增加患肺腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。目前在哺乳類(lèi)基因組中共發(fā)現(xiàn)GPC1到GPC6的6個(gè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖成員，均歸屬于磷脂酰肌醇蛋白聚糖(heparan sulphate proteoglycans，HSPGs)大類(lèi)，HSPGs主要通過(guò)糖基-磷脂酰肌醇錨錨定在細(xì)胞膜的表面，從而在細(xì)胞

2、生長(zhǎng)及分化中扮演重要角色。對(duì)于GPC5基因的研究發(fā)現(xiàn)，GPC5基因的高表達(dá)或低表達(dá)與人體多部位、多種類(lèi)型的腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，例如淋巴瘤、橫紋肌肉瘤及結(jié)腸癌等。但關(guān)于GPC5如何在肺腺癌中發(fā)揮作用及其在細(xì)胞水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)的影響如何，當(dāng)前尚存在爭(zhēng)議。本課題構(gòu)建GPC5相關(guān)的肺腺癌細(xì)胞模型，全面研究GPC5對(duì)肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)的促進(jìn)或抑制作用，從而為進(jìn)一步探索GPC5在肺腺癌中的功能定義及分子機(jī)制探索提供理論依據(jù)。
　　

3、方法:
　　1.采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實(shí)時(shí)定量RT-PCR(qRT-PCR)分析肺腺癌細(xì)胞系中GPC5基因mRNA表達(dá)情況;同時(shí)，采用Western blot(WB)的方法驗(yàn)證肺腺癌細(xì)胞系中GPC5基因在蛋白水平的不同表達(dá)情況。
　　2.利用真核載體構(gòu)建GPC5過(guò)表達(dá)載體及干擾載體，并通過(guò)脂質(zhì)體法將GPC5過(guò)表達(dá)載體及干擾載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞，構(gòu)建GPC5過(guò)表達(dá)及GPC5沉默細(xì)胞模型。
　　3.利用CCK-8法觀察

4、GPC5過(guò)表達(dá)及沉默對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響。
　　4.通過(guò)流式細(xì)胞熒光分析的方法，探究GPC5過(guò)表達(dá)及沉默對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的相關(guān)影響。
　　5.通過(guò)Transwell小室系統(tǒng)觀察肺腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移活動(dòng)，探究GPC5過(guò)表達(dá)及沉默對(duì)細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的相關(guān)影響。
　　結(jié)果:
　　1.檢測(cè)GPC5基因在4株人肺腺癌細(xì)胞系（A549、H1299、H358和H1975）和正常肺組織中的mRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與正常肺組

5、織相比，GPC5基因的表達(dá)量在這4株人肺腺癌細(xì)胞系中均較低;僅對(duì)基因表達(dá)的細(xì)胞系之間的比較分析，發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中GPC5基因低表達(dá)，在H1299細(xì)胞中則高表達(dá);對(duì)蛋白表達(dá)的檢測(cè)分析與mRNA水平一致。
　　2.通過(guò)前期mRNA及蛋白表達(dá)檢測(cè)，選取A549細(xì)胞完成GPC5過(guò)表達(dá)細(xì)胞系模型的建立及鑒定工作，選取H1299細(xì)胞完成GPC5沉默細(xì)胞系模型的建立及鑒定工作。
　　3.與陰性對(duì)照組比較分析，GPC5過(guò)表達(dá)細(xì)胞系生長(zhǎng)受

6、到抑制，轉(zhuǎn)染后第三天抑制作用最強(qiáng)，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)OD值為2.21±0.09，過(guò)表達(dá)組OD值為1.51±0.07;GPC5沉默細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)得到促進(jìn)，轉(zhuǎn)染后第四天促進(jìn)效果最明顯，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)OD值為1.81±0.07，干擾組OD值為2.51±0.05，兩組的差異比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.GPC5基因過(guò)表達(dá)引起A549細(xì)胞G1期增加，G2、S期降低，與對(duì)照組相比G1期和S期變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0

7、.05); GPC5基因沉默引起H1299細(xì)胞G1、G2期下降，S期增高，與對(duì)照組G1期和S期比率變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　5.與陰性對(duì)照相比，GPC5基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞總凋亡率由10.03％降到8.99％，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同樣在GPC5沉默細(xì)胞系H1299中也未觀察到細(xì)胞總凋亡率之間的差異。
　　6.GPC5過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組遷移到膜下側(cè)的細(xì)胞數(shù)明顯減少，穿膜細(xì)胞數(shù)為（28.2±2.5），陰性對(duì)照組則為（

8、59.6±1.81）。同時(shí)對(duì)于GPC5沉默實(shí)驗(yàn)組，GPC5沉默實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，沉默組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)為（14±2），陰性對(duì)照組則為（2.33±0.58），與陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　7.GPC5過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)基質(zhì)膠后進(jìn)入膜下側(cè)的細(xì)胞數(shù)明顯減少，過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)（9.2±0.7），陰性對(duì)照組（20.3±2）。同時(shí)對(duì)于GPC5沉默實(shí)驗(yàn)組，GPC5沉默組的穿膜細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，