人CC10基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、第一部分CC10在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)及其與癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系 目的 研究CC10蛋白在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)并觀察其與癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 方法 采用免疫組化技術(shù)檢測CC10在43例NSCLC及20例肺良性疾病組織石蠟標(biāo)本中的表達(dá)，并借助HPIAS-1000圖像系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析。應(yīng)用TUNEL技術(shù)檢測其中的43例NSCLC癌細(xì)胞的凋亡并分析其與CC10表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果

2、 CC10在NSCLC中的表達(dá)為46.51％(20/43)，明顯低于肺良性病變組織85.0％(P＜0.01)；CC10在肺癌中的表達(dá)與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤組織學(xué)分型無關(guān)(P＞0.05)；CC10表達(dá)陽性肺癌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)為5.585±1.7822％，CC10表達(dá)陰性肺癌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)為2.8565±1.3990％，癌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)與NSCLC中CC10蛋白

3、的表達(dá)有顯著相關(guān)性(Rs=-0.0211，P＜0.05)。 結(jié)論 NSCLC中CC10的表達(dá)下調(diào)，NSCLC細(xì)胞的凋亡的與CC10的表達(dá)下調(diào)密切相關(guān). 第二部分構(gòu)建及鑒定人CC10基因真核細(xì)胞表達(dá)載體 目的 構(gòu)建及鑒定人CC10基因真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1-hCC10。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法 RT-PCR法從人肺正常組織的總RNA中克隆出273bp大小的cDNA片段，限

4、制性內(nèi)切酶HindⅢ/BamⅠ作用真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1，取純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約30ng和pcDNA3.1質(zhì)粒載體大片段約75ng，在T4DNA連結(jié)酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。再將其將該重組子轉(zhuǎn)化DH5a.感受態(tài)大腸桿菌，篩選及抽提陽性克隆菌株，HindⅢ/BamⅠ雙酶酶切該重組子并行序列鑒定。 結(jié)果 該273bpcDNA與基因文庫中CC1外顯子1序列完全相同，人CC10基因已經(jīng)正確克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDN

5、A3.1中。 結(jié)論 成功構(gòu)建了pcDNA3.1-hCC10真核細(xì)胞表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究肺癌的發(fā)病機(jī)制及治療打下基礎(chǔ)。 第三部分建立穩(wěn)定表達(dá)外源性人CC10基因的肺癌細(xì)胞株 目的 建立穩(wěn)定表達(dá)外源性人CC10基因的肺癌A549細(xì)胞株 方法 大提試劑盒提取pcDNA3.1-hCC10，并利用脂質(zhì)體法分別將pcDNA31-hCC10及pcDNA3.1轉(zhuǎn)入試驗(yàn)組A及B組的A549細(xì)胞中，

6、而C組未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染的對照組，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá).Westernblot法檢測轉(zhuǎn)染各組A549細(xì)胞CC10蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測CC10mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 A組A549細(xì)胞CC10mRNA及蛋白的表達(dá)較其他兩組高。 結(jié)論 我們成功建立了穩(wěn)定表達(dá)外源性人CC10基因的肺癌A549細(xì)胞株，為下步的研究工作奠定基礎(chǔ)。 第四部分人CC10基因逆轉(zhuǎn)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影

7、響 目的 研究人CC10基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖及凋亡的影響.及其對CyclinD1蛋白及mRNA表達(dá)的影響。 方法 分別通過脂質(zhì)體法將所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CC10(A組)及空質(zhì)粒(B組)，并設(shè)未行轉(zhuǎn)染的陰性對照組(C組)：；通過Hoechst33258染色法、透射電鏡及、AnnexinV-PI雙標(biāo)法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、A549細(xì)胞移植裸鼠成瘤等實(shí)驗(yàn)觀察CC10基因?qū)Ω鹘MA54

8、9細(xì)胞在體內(nèi)、體外的凋亡及生長的影響；流式細(xì)胞儀及WesternBlot、RT-PCR檢測CC10對A549細(xì)胞細(xì)胞周期及周期蛋白CyclinD1的表達(dá)的影響。 結(jié)果 A組細(xì)胞體外生長；克隆形成及體內(nèi)荷瘤的生長明顯受抑，可觀察到典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)增多，細(xì)胞凋亡率增高，與B組及C組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p＜0.05；隧轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，更多A549細(xì)胞停滯與G1期，CyclinD1基因表達(dá)也逐漸下調(diào)。 結(jié)論 人