RNAi沉默STIM1基因?qū)θ宋赴┘毎飳W(xué)行為的影響.pdf

1、目的：基質(zhì)交感分子1(stromal interaction molecule1，STIM1)是一種主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，廣泛表達于動物細胞及腫瘤細胞，其主要功能是偵測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+濃度變化而調(diào)控SOCC形成鈣釋放激活鈣通道，從而影響多種細胞的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)功能。但關(guān)于STIM1與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)性的研究至今尚未見報道，為此，本研究擬以胃癌SGC7901細胞為研究對象，在細胞水平觀察沉默STIM1對細胞內(nèi)Ca

2、2+信號以及胃癌細胞的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為的影響，為臨床上胃癌的防治提供新思路及新靶點。
　　方法：采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將本實驗室保存的STIM1干擾質(zhì)粒pGPU6/shSTIM1和陰性質(zhì)粒pGPU6/shSTIM1-NC瞬時轉(zhuǎn)染SGC7901細胞。實驗隨機分為三組:空白對照組、陰性對照組、STIM1沉默組。轉(zhuǎn)染48 h后，采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率;Western Blot測定STIM1蛋白的

3、沉默效率;單細胞鈣離子成像系統(tǒng)檢測STIM1沉默后胞內(nèi)Ca2+信號變化情況;MTT法檢測細胞增殖能力;Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲能力;流式細胞技術(shù)實驗檢測胃癌細胞凋亡及細胞周期變化情況。
　　結(jié)果：⑴pGPU6和pGPU6-shSTIM1質(zhì)粒由脂質(zhì)體介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細胞，轉(zhuǎn)染效率均達80％。⑵Western-blotting檢測結(jié)果顯示:空白對照組、陰性對照組、STIM1沉默組STIM1蛋白相對灰度值分

4、別為0.73±0.03、0.69±0.02、0.29±0.05，STIM1沉默組與空白對照組及陰性對照組比較，沉默組STIM1蛋白表達水平顯著降低(P＜0.01)，而后兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示轉(zhuǎn)染特異性STIM1-siRNA后可顯著抑制STIM1蛋白表達水平。⑶單細胞Ca2+離子成像系統(tǒng)檢測胞內(nèi)鈣信號結(jié)果顯示:STIM1沉默組與空白對照組及陰性對照組比較，沉默組胞內(nèi)Ca2+增加幅度明顯降低（均P＜0.05），而后兩組比

5、較，胞內(nèi)Ca2+增加幅度無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。⑷MTT實驗結(jié)果顯示:STIM1-siRNA抑制胃癌SGC7901細胞的增殖在24 h、48 h、72 h抑制率分別為37％、41％、27％，與陰性對照組比較，STIM1沉默組抑制率明顯增加(P＜0.05)，且在轉(zhuǎn)染48 h時抑制胃癌細胞增作用最明顯。⑸流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示:空白對照組、陰性對照組、STIM1沉默組胃癌細胞SGC7901凋亡率分別為7.95±0.08％、9.

6、01±0.03％、36.98±0.13％，STIM1沉默組與空白對照組及陰性對照組比較，沉默組細胞凋亡率明顯增加（均P＜0.05），而后兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。⑹流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示:各組胃癌細胞SGC7901培養(yǎng)48h后，空白對照組和陰性對照組胃癌細胞周期分布情況:G0/G1期為35.63±1.07％、S期為51.30±0.71％、G2/M期為13.14±0.81％;G0/G1期為37.46±0.67％、S期

7、為50.89±0.87％、G2/M期為11.64±0.30％;沉默組胃癌細胞G0/G1期為62.38±0.91％、S期為29.53±0.71％、G2/M期為8.09±0.65％;沉默組胃癌細胞大多數(shù)處于G0/G1周期，而S期和G2/M期的水平明顯下降，其SPF值、PI值明顯小于空白對照組及陰性對照組（均P＜0.05），而陰性對照組與空白對照組比較，SPF值及PI值無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。⑺體外遷移實驗（Transwell實驗）結(jié)果

8、顯示:空白對照組、陰性對照組、STIM1沉默組穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)分別為44.67±1.53、41.00±2.02、14.50±2.29，沉默組與空白對照組及陰性對照組比較，沉默組穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，而后兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示沉默STIM1可明顯抑制胃癌細胞SGC7901體外遷移能力。⑻體外侵襲實驗結(jié)果顯示:空白對照組、陰性對照組、STIM1沉默組穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)分別為26.33

9、±1.53、21.67±2.52、7.33±1.23，沉默組與空白對照組及陰性對照組比較，沉默組穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，而后兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示沉默STIM1可明顯抑制胃癌細胞SGC7901體外侵襲能力。
　　結(jié)論：STIM1基因抑制后，胃癌細胞鈣內(nèi)流減少，增殖能力減緩、細胞周期阻滯于G0/G1期、凋亡率增加、遷移、侵襲能力減弱。表明STIM1是調(diào)控胃癌細胞增殖、遷移、侵襲過程中的重