RNAi沉默ADAMs家族基因?qū)δ[瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.pdf

1、華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文RNAi沉默ADAMs家族基因?qū)δ[瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的影響姓名：豐菁申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：唐艷平20090501華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文5shRNA）對(duì)N2a細(xì)胞中目的基因的沉默效應(yīng)，即是否能抑制靶基因在哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞中目的基因的表達(dá)，為進(jìn)一步利用RNA干擾技術(shù)對(duì)抗腫瘤的基因治療提供新的依據(jù)和手段。方法方法：利用DNA重組技術(shù)針對(duì)ADAM10和PC7基因的shRNA序列克隆到pGensil1

2、中，構(gòu)建shRNA真核表達(dá)載體，通過(guò)酶切和測(cè)序等方法進(jìn)行鑒定。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將已構(gòu)建好的重組干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞株，免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，采用半定量RTPCR和Western免疫印跡法分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后目的基因的表達(dá)，以及小鼠腦內(nèi)注射重組干擾質(zhì)粒pGensil1PC7后，在體觀察局部轉(zhuǎn)染后綠色熒光的表達(dá)，以了解RNA干擾效果。結(jié)果結(jié)果：成功構(gòu)建了真核干擾載體pGensil1ADAM10，pGens

3、il1PC7；免疫熒光結(jié)果顯示外源性干擾質(zhì)粒在神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞中獲得瞬時(shí)表達(dá)，基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)率可達(dá)90%；兩目的基因mRNA相對(duì)水平（與內(nèi)參的灰度比值）：空白對(duì)照組分別為1.350.09、1.390.05，陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組分別為1.250.07、1.270.08，shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別為0.350.03、0.620.05，可見(jiàn)shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組較其他兩組明顯降低（P0.01）。細(xì)胞中目的基因的蛋白水平變化趨勢(shì)與mRNA表

4、達(dá)相似?；叶葤呙杵毓鈾z測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組重組干擾質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入小鼠體內(nèi)有較強(qiáng)綠色熒光的表達(dá)，與對(duì)照組具有顯著差異性。結(jié)論結(jié)論：我們構(gòu)建的shRNA干擾載體能有效沉默小鼠N2a細(xì)胞中靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而可能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖促其凋亡，為下一步在動(dòng)物體內(nèi)利用重組干擾質(zhì)粒沉默目的基因的表達(dá)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞：短發(fā)夾狀RNA；ADAM10；N2a細(xì)胞株；基因干擾綜上所述，研究證實(shí)應(yīng)用短發(fā)夾狀RNA介導(dǎo)的干擾技術(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞可以取得明顯干涉效