PPARs配體對巨噬、泡沫細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.pdf

1、過氧化物酶體增殖物激活受體是一種由致密分子構(gòu)成的類固醇受體,屬于由配體激活的Ⅱ型核受體超家族成員.該實(shí)驗(yàn)擬運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù),對上述問題進(jìn)行研究,以期為臨床上使用PPARs配體防治動(dòng)脈粥樣硬化提供更完善的實(shí)驗(yàn)依據(jù).方法:1.采用THP-1單核細(xì)胞,加佛波醇(PMA)40ng/ml培養(yǎng)16~24h,誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞,加入ox-LDL50ug/ml共同培養(yǎng)24h以上,誘導(dǎo)分化為泡沫細(xì)胞.應(yīng)用RT-PCR測定PPAR α、γ基

2、因表達(dá).加入PPAR α配體clofibrate、PPAR γ配體pioglitazone進(jìn)行干預(yù),24h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子IL6、TNFα及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9濃度,Gelatin Zymography測定MMPs活性.2.誘導(dǎo)THP-1分化為巨噬細(xì)胞,加入胰島素0.1uM繼續(xù)培養(yǎng),分別于1h、2h、4h、8h、10h、12h、24h抽提細(xì)胞總RNA,對PPAR γ mRN

3、A行RT-PCR半定量分析,以同一時(shí)段未加胰島素培養(yǎng)之巨噬細(xì)胞作對照.巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功后,換用含3‰胎牛血清PRMI 1640培養(yǎng)基,分別加入胰島素0.25uM、0.5uM繼續(xù)培養(yǎng)48h,提取總蛋白對PPAR γ行Western blot檢測.誘導(dǎo)THP-1分化為巨噬細(xì)胞,根據(jù)干預(yù)因子不同分組:(1)單純巨噬細(xì)胞組:(2)pioglitazone 20uM組;(3)pioglitazone 20uM+胰島素RIO.25uM組:(4)pi

4、oglitazone 20uM+胰島素RIO.5uM組,同時(shí)培養(yǎng)24h,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液.ELISA法測定IL6、TNF-α、MMP-9濃度,Gelatin Zymography測定MMP-9活性.3.誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞分化為巨噬、泡沫細(xì)胞,加入PPAR α配體clofibrate、PPAR γ配體pioglitazone進(jìn)行干預(yù),收集24h和48h細(xì)胞培養(yǎng)上清液.用Real-timePCR、Western blot分別檢測不同分

5、化階段和不同干預(yù)條件下細(xì)胞的EMMPRIN基因和蛋白水平,ELISA法測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9濃度,Gelatin Zymography法測MMP-9活性.結(jié)論:提示泡沫細(xì)胞中有PPAR α、γ基因表達(dá).PPAR α、γ配體均有利于抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊局部炎癥反應(yīng),PPAR γ配體還可降低基質(zhì)金屬蛋白酶的釋放并抑制其活性,對增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性有利.胰島素對巨噬細(xì)胞PPAR γ基因、蛋白的表達(dá)均無顯著影響.胰島素可消弱PPAR γ配體抑