TNF-α作用下自噬對(duì)人根尖乳頭干細(xì)胞生物學(xué)特性影響的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著牙髓再生治療術(shù)的開展應(yīng)用，臨床上已有越來越多患牙髓炎或根尖周炎的年輕恒牙經(jīng)治療后，牙根繼續(xù)發(fā)育以及根尖孔閉合。其中，位于根尖部牙乳頭組織中的根尖乳頭干細(xì)胞（Stem cells from apical papilla，SCAPs），由于具有高效的多向分化潛能，且在外界刺激時(shí)可從根尖區(qū)域遷移至受損部位進(jìn)行增殖、分化，因此在牙髓再生治療術(shù)中起重要作用。自噬是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種溶酶體依賴性的降解途徑，對(duì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的

2、維持具有重要作用，可參與防御細(xì)胞感染及影響細(xì)胞免疫反應(yīng)。研究證實(shí)，自噬參與血管生成、神經(jīng)生成、骨生成等過程，對(duì)維持干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)、自我更新能力、多向分化潛能具有重要作用。細(xì)胞外刺激因素如饑餓、炎性因子（TNF-α）等，均能激活細(xì)胞自噬水平的活化。TNF-α是參與牙髓、根尖周炎癥的重要細(xì)胞因子，本課題組前期研究已證實(shí)TNF-α可促進(jìn)SCAPs的增殖并參與調(diào)控其成骨/成牙本質(zhì)分化能力。研究報(bào)道，TNF-α可誘導(dǎo)多種細(xì)胞自噬水平的活化，如巨噬細(xì)

3、胞、骨骼肌細(xì)胞、破骨細(xì)胞等，然而關(guān)于 TNF-α作用下人 SCAPs自噬水平的變化，以及自噬對(duì)其凋亡、分化能力影響的研究仍知之甚少。了解TNF-α作用下自噬對(duì)人SCAPs的影響，有利于我們更深入的理解炎癥狀態(tài)下人SCAPs的生物學(xué)特性改變，從而有助于為臨床牙髓再生治療術(shù)提供新思路。
　　研究目的：
　　本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诔醪教接?TNF-α對(duì)人 SCAPs自噬水平的影響及其可能相關(guān)的機(jī)制；初步探討自噬對(duì)TNF-α作用下人SCAP

4、s的凋亡及成骨分化的影響，為后續(xù)對(duì)炎癥微環(huán)境下自噬與人SCAPs分化關(guān)系的研究提供一定的參考。
　　方法：
　　1、TNF-α影響人根尖乳頭干細(xì)胞自噬水平及相關(guān)機(jī)制的初步研究
　　體外通過改良組織塊培養(yǎng)法和有限稀釋法培養(yǎng)獲得人SCAPs。蛋白免疫印跡法（Western blot）、GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、吖啶橙染色檢測(cè)不同濃度TNF-α（5、10 ng/mL）作用下SCAPs的自噬水平改變。Western blot法檢

5、測(cè)TNF-α（5、10 ng/mL）作用下SCAPs的ERK1/2通路的磷酸化水平，及TNF-α（5 ng/mL）+U0126（0、10、20、30μM）分別作用下SCAPs的自噬水平及ERK1/2通路的磷酸化水平。
　　2、抑制自噬對(duì)TNF-α作用下人根尖乳頭干細(xì)胞凋亡及成骨分化影響的初步研究
　　TNF-α（5 ng/mL）、TNF-α（5 ng/mL）+3-MA（5 mM）分別處理SCAPs， Western blot

6、、GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染檢測(cè)SCAPs的自噬水平；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。TNF-α（5 ng/mL）、TNF-α（5 ng/mL）+3-MA（5 mM）分別處理SCAPs并誘導(dǎo)成骨向分化，qRT-PCR檢測(cè)成骨向分化第3、7、14天時(shí)成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OCN的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、Western blot、GFP-LC3轉(zhuǎn)染、吖啶橙染色結(jié)果均表明，5、10 ng/mL TNF-α作

7、用下SCAPs的自噬水平顯著上調(diào)（P＜0.05），且10 ng/mL TNF-α較5 ng/mL TNF-α誘導(dǎo)SCAPs自噬的能力更強(qiáng)（P＜0.05）。Western blot顯示5、10 ng/mL TNF-α作用下SCAPs的p-ERK/ERK水平升高（P＜0.05）；20、30μM U0126處理能有效降低p-ERK/ERK及LC3-II/β-actin水平（P＜0.05），10μM U0126作用下p-ERK/ERK及LC3-

8、II/β-actin水平與對(duì)照組無明顯差異。
　　2、Western blot和GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，自噬抑制劑3-MA能顯著抑制TNF-α作用下SCAPs自噬水平的活化（P＜0.05）。CCK-8結(jié)果顯示：TNF-α處理組細(xì)胞活力與對(duì)照組無明顯差異，TNF-α+3-MA處理組細(xì)胞活力較TNF-α處理組下降（P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：TNF-α處理組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組無明顯差異，TNF-α+3-MA處理組細(xì)

9、胞凋亡率較TNF-α處理組顯著上調(diào)（P＜0.05）。qRT-PCR結(jié)果顯示：TNF-α處理組的成骨相關(guān)基因ALP、OCN、BSP表達(dá)量在第3、7、14天較對(duì)照組均增加（P＜0.05）；TNF-α+3-MA處理組的ALP、BSP表達(dá)量在第3、7、14天較TNF-α處理組均降低（P＜0.05），OCN的表達(dá)量在第3、7天較TNF-α處理組降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. TNF-α能誘導(dǎo)SCAPs自噬水平的活化，可能