尼古丁對(duì)大鼠髕腱肌腱干細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探討體外尼古丁對(duì)大鼠髕腱肌腱干細(xì)胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）的細(xì)胞活力，細(xì)胞早期凋亡以及肌腱相關(guān)基因表達(dá)的影響，揭示吸煙導(dǎo)致肌腱病變以及損傷肌腱延遲愈合潛在的細(xì)胞學(xué)發(fā)病機(jī)制。
　　方法:無(wú)菌條件下取8周齡SD大鼠的髕腱，Ⅰ型膠原酶消化分離獲得單個(gè)有核細(xì)胞，以最適密度（50個(gè)/cm2）進(jìn)行接種，細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，獲得原代TDSCs。基礎(chǔ)培養(yǎng)細(xì)胞至第3代，行成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化鑒定其

2、干細(xì)胞的特性。然后將其分為兩組，實(shí)驗(yàn)組用不同濃度的尼古丁培養(yǎng)基(10-7M，10-6M，10-5M，10-4M和10-2M)干預(yù)，對(duì)照組繼續(xù)采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0M)培養(yǎng)。處理6h、24h、48h和72h后分別應(yīng)用四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)尼古丁對(duì)TDSCs體外存活的影響，72h后應(yīng)用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)尼古丁對(duì)TDSCs體外早期凋亡的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime PCR)檢測(cè)肌腱相關(guān)基因Collal和S

3、cx的表達(dá)。
　　結(jié)果:大鼠髕腱TDSCs體外培養(yǎng)呈克隆樣集落生長(zhǎng)，首次換液后，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形和多角形兩種形態(tài)，傳至第3代，細(xì)胞表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣的紡錘形和星形的扁平細(xì)胞。TDSCs成骨誘導(dǎo)7天，茜素紅染色陽(yáng)性;成脂誘導(dǎo)10天，油紅O染色陽(yáng)性;成軟骨誘導(dǎo)14天，蘇木精-伊紅染色陽(yáng)性。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組不同濃度的尼古丁干預(yù)下，TDSCs的細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì)，呈時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性，濃度高于10-4M時(shí)作用顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

4、p＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)TDSCs早期凋亡(AnnexinⅤ+/PI-)的數(shù)量隨著尼古丁濃度的增加而增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。同時(shí)，Realtime PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中Collal和Scx的mRNA表達(dá)水平均降低，濃度高于10-5M時(shí)作用顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:大鼠髕腱中可以分離培養(yǎng)出具有體外克隆形成以及多向分化潛能的肌腱干細(xì)胞。體外尼古丁可抑制大鼠髕腱T