體外持續(xù)傳代對(duì)人胎兒來(lái)源干細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、目的:研究體外持續(xù)傳代對(duì)兩種人胎兒來(lái)源干細(xì)胞（臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞）基本特性、致瘤性及干性等生物學(xué)特性的影響，為干細(xì)胞的質(zhì)量監(jiān)控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:使用相同方法分離獲得的原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(n=3)和羊膜上皮細(xì)胞(n=8)進(jìn)行持續(xù)傳代培養(yǎng)，研究第7、14和21代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞基本特性（形態(tài)、增殖、細(xì)胞周期、凋亡和衰老）、致瘤性（染色體數(shù)量和致瘤基因表達(dá)）以及干性（表型、干性基因表達(dá)、心肌、神經(jīng)和肝分化能力）的差

2、別，并探討原代羊膜上皮細(xì)胞干性標(biāo)志物SSEA-4的表達(dá)水平與體外培養(yǎng)后細(xì)胞表型以及分化能力變化的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果:
　　1.持續(xù)傳代對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　1)持續(xù)傳代對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞基本特性的作用規(guī)律
　　初代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，隨著傳代次數(shù)的增加，部分細(xì)胞變得寬大，細(xì)胞增殖速率下降，出現(xiàn)了S和G2期阻滯現(xiàn)象，但三個(gè)代數(shù)細(xì)胞間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，三個(gè)代數(shù)細(xì)胞均未發(fā)生明顯凋亡:活細(xì)胞（

3、Annexin(V)-/PI-細(xì)胞）比例均超過(guò)90％，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，與第7代及第14代相比，第21代衰老細(xì)胞比例顯著增高(P7:0.032±0.018;P14:0.062±0.038;P21:0.229±0.019)。衰老相關(guān)的P21基因表達(dá)也顯著升高(P21:0.050±0.020, P14:0.007±0.001, P7:0.010±0.004)(P＜0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第14代以內(nèi)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠較好地保持其

4、基本特性，而第21代細(xì)胞則出現(xiàn)了明顯衰老。
　　2)持續(xù)傳代對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞致瘤性的作用規(guī)律
　　三個(gè)代數(shù)細(xì)胞染色體數(shù)量未發(fā)生變化，癌基因E-Ras的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，第21代癌基因c-Myc(0.047±0.005)的表達(dá)則顯著高于第7(0.014±0.006)和14代(0.011±0.002)(P＜0.05)。這些結(jié)果表明，盡管第21代細(xì)胞染色體數(shù)量正常，但癌基因的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)明顯上調(diào)，提示高代數(shù)細(xì)胞可能具有較高的

5、致瘤性。
　　由于第21代細(xì)胞衰老和癌基因表達(dá)均顯著升高，因此在之后的干性研究中只選擇使用第7和第14細(xì)胞。
　　3)持續(xù)傳代對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞干性的作用規(guī)律
　　三個(gè)代數(shù)細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞典型的表面標(biāo)志物(CD73、CD90和CD105)表達(dá)均高于99％，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物HLA-DR和CD45，各代數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與第7代細(xì)胞相比，第14代細(xì)胞的干性基因Oct3/4(P7:2.378E-5±1.347E-5,

6、P14:1.955E-5±3.692E-6)、Nanog(P7:1.063E-5±5.722E-6, P14:6.517E-6±2.666E-6)、Vimentin(P7:0.507±0.144，P14:0.323±0.041)，外胚層祖細(xì)胞標(biāo)志物Nestin(P7:9.421E-4±2.011E-4，P14:6.952E-4±2.906E-4)和中胚層祖細(xì)胞標(biāo)志物GATA4（P7:3.215E-5±3.716E-5，P14:5.082

7、E-6±5.293E-6）的表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)，內(nèi)胚層祖細(xì)胞標(biāo)志物AFP(P7:5.891E-5±2.439E-5，P14:9.916E-5±2.620E-5)有上調(diào)趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，心肌誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:第7代細(xì)胞的心肌標(biāo)志物α-actinin的蛋白表達(dá)(0.111±0.030)顯著高于第14代(0.033±0.006)細(xì)胞(P＜0.05)，這說(shuō)明第7代細(xì)胞具有較高的心肌分化能力。神經(jīng)誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示:第14代細(xì)胞中N

8、estin(27.2±12.0％)、β-tubulinⅢ(70.4±4.5％)陽(yáng)性細(xì)胞的比例較之第7代(Nestin:20.9±0.8％;β-tubulinⅢ:38.6±10.2％)細(xì)胞表達(dá)升高，β-tubulinⅢ有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，Nestin無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，這說(shuō)明第14代細(xì)胞具有較高的神經(jīng)分化能力。此外，早期肝誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第7代細(xì)胞的肝功能標(biāo)志物Albumin的基因(P7:16.433±12.92

9、1，P14.12.967±1.358)(P＜0.05)及蛋白表達(dá)(P7:0.382±0.270，P14:0.260±0.127)有高于P14代的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示第7代細(xì)胞可能具有較高的肝分化潛能，但受到個(gè)體差異的影響。
　　2.持續(xù)傳代對(duì)羊膜上皮細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　流式細(xì)胞儀分析表明，不同樣本來(lái)源的原代羊膜上皮細(xì)胞干性標(biāo)志物SSEA-4的表達(dá)在26.7％-97％之間，存在很大的個(gè)體差異。第2代細(xì)胞與原代細(xì)胞相

10、比，SSEA-4表達(dá)水平明顯降低，其下降程度與原代細(xì)胞SSEA-4的表達(dá)水平無(wú)關(guān)。另外，傳代培養(yǎng)后羊膜上皮細(xì)胞的心肌分化潛能也存在很大個(gè)體差異，且其差異與原代細(xì)胞SSEA-4表達(dá)水平的高低無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.第14代之內(nèi)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞較好地保持了其基本特性，未發(fā)生明顯衰老，且具有較低的癌基因表達(dá)，因此更適合再生醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用。
　　2.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)表明，盡管受到個(gè)體差異的影響，但是體外持續(xù)傳代對(duì)

11、不同分化方向有不同的作用規(guī)律，較低代數(shù)細(xì)胞的心肌及肝分化能力可能較高，而較高代數(shù)細(xì)胞的神經(jīng)分化能力可能較強(qiáng)，因此在具體應(yīng)用中需要考慮體外傳代對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具體分化方向及能力的影響，盡可能選擇適合代數(shù)的細(xì)胞，同時(shí)加強(qiáng)干細(xì)胞的質(zhì)量監(jiān)控，以提高安全性和有效性。
　　3.不同樣本來(lái)源的原代羊膜上皮細(xì)胞的SSEA-4表達(dá)水平受到個(gè)體差異的影響，需要建立更準(zhǔn)確的臨床樣本篩選指標(biāo)來(lái)穩(wěn)定獲得原代高表達(dá)SSEA-4的胎兒樣本，以實(shí)現(xiàn)對(duì)羊膜上皮細(xì)