慢病毒介導(dǎo)的RNAi沉默p21基因?qū)β谷赘杉?xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的：鹿茸是一種可完全再生的哺乳動(dòng)物附屬器官，被作為一種生物學(xué)模型受到廣大學(xué)者的關(guān)注，搞清鹿茸再生機(jī)制有望為人類肢體再生提供可借鑒的理論依據(jù)。生茸區(qū)骨膜細(xì)胞（APCs）與角柄骨膜細(xì)胞(PPCs)分別是鹿茸發(fā)生與再生的關(guān)鍵，均具有干細(xì)胞特性，因此也分別稱為鹿茸發(fā)生干細(xì)胞(SCAG)與鹿茸再生干細(xì)胞(SCAR)。有限的鹿茸干細(xì)胞可以在短短的兩個(gè)月內(nèi)生成完整的鹿茸組織，這在其他哺乳動(dòng)物器官組織中是不可能完成的。組織器官再生源于細(xì)胞的分裂增殖，

2、細(xì)胞的分裂增殖依賴于細(xì)胞周期調(diào)控，因此對(duì)鹿茸干細(xì)胞周期的研究對(duì)揭示鹿茸再生機(jī)制具有重要意義。p21是一種細(xì)胞周期的主要調(diào)控因子，與p53共同構(gòu)成細(xì)胞周期的G1檢查點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn) p21單基因敲除使普通小鼠獲得了同 MRL小鼠一樣閉合耳洞的能力，同時(shí)相關(guān)再生細(xì)胞具有特殊的細(xì)胞周期分布（G2/M阻滯），很多再生模型中也都發(fā)現(xiàn)了相同的G2/M積聚現(xiàn)象。但檢測(cè)鹿茸干細(xì)胞周期，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特殊的G2/M期阻滯（未發(fā)表），推測(cè)可能與p21基因有關(guān)，為證明

3、這一假設(shè)，并探討p21基因在鹿茸再生中的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA干擾技術(shù)來(lái)研究沉默p21基因?qū)β谷赘杉?xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　方法：1、利用在線設(shè)計(jì)軟件與通用RNAi設(shè)計(jì)法則篩選出針對(duì)東北梅花鹿p21基因的RNAi高分靶位點(diǎn)，化學(xué)合成并體外退火，與載體質(zhì)粒PLVTHM重組，通過(guò)PCR鑒定及測(cè)序鑒定篩選出陽(yáng)性質(zhì)粒。2、重組質(zhì)粒與pMD2.G、pCMV-dr8.9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293t細(xì)胞，收集并濃縮含有目的基因的慢病毒載體。慢病毒感染

4、，流式細(xì)胞儀分選陽(yáng)性細(xì)胞，Q-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PP細(xì)胞中mRNA表達(dá)量。3、MTT法檢測(cè)細(xì)胞在傳代早期與后期的增殖速率；流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡；β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老；彗星電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DN A損傷。
　　結(jié)果：1、成功篩選了2條針對(duì)東北梅花鹿P21基因的RNAi高分靶位點(diǎn)并化學(xué)合成，體外退火獲得雙鏈寡核苷酸鏈；2、與載體質(zhì)粒PLVTHM連接，成功獲得重組質(zhì)粒；3、通過(guò)三質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，成功獲得大量慢

5、病毒粒子；4、通過(guò)感染PP細(xì)胞并分選，獲得穩(wěn)定感染的細(xì)胞株；5、RT-PCR檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞p21基因mRNA表達(dá)量顯著降低；6、對(duì)感染后細(xì)胞生物學(xué)特性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：傳代早期細(xì)胞增殖速率無(wú)顯著變化，傳代后期細(xì)胞增殖速度明顯高于對(duì)照組；細(xì)胞周期無(wú)顯著變化；細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增多；細(xì)胞衰老被抑制；細(xì)胞DN A損傷明顯增加。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了針對(duì)東北梅花鹿p21基因的慢病毒表達(dá)載體，并獲得了p21基因沉默的穩(wěn)定PP細(xì)胞株，為p21基因