慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默Id1對(duì)腸癌HCT116細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)特性和侵襲轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、背景和目的：
　　結(jié)直腸癌（ColorectalCancer,CRC）發(fā)病率占所有癌癥中第四位，其死亡率占第二位。雖然結(jié)直腸癌患者目前可以得到以手術(shù)、化療和放療等多種手段的綜合治療，大約有40％的患者即使進(jìn)行綜合治療后依然出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，5年生存率僅50%左右。越來越多的證據(jù)表明，CRC的發(fā)展過程中腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞（Cancer stem-like cells，CSLCs）或者腫瘤干細(xì)胞（Cancerstem cells，CSCs

2、）具有重要的作用，是促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。
　　近年來，研究發(fā)現(xiàn)分化抑制因子1（Inhibitors ofdifferentiation1,Id1）在多種癌癥中高表達(dá)，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、食管癌和CRC，是新的腫瘤相關(guān)基因。Id1在其他癌癥中被證明具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，同時(shí)具有維持胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞自我更新的功能。雖然，在CRC中，僅有少量的研究表明Id1具有促進(jìn)早期血行轉(zhuǎn)移和調(diào)節(jié)CS

3、Cs的自我更新的作用，但是，Id1對(duì)CRC肝轉(zhuǎn)移以及腸癌CSCs相關(guān)特性的影響需要進(jìn)一步驗(yàn)證，并且其中可能存在的機(jī)制值得進(jìn)一步探討。
　　因此，本次研究，我們首先分析Id1和最常見的腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的表達(dá)之間關(guān)系,以明確Id1和CD133表達(dá)相關(guān)性及其臨床意義；其次，采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾基因水平抑制HCT116細(xì)胞Idl表達(dá),觀察Idl基因沉默后體外自我更新功能的變化,體內(nèi)啟動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)能力的改變，并且探討腸癌干細(xì)胞

4、最重要的信號(hào)通路（Wnt/β-catenin通路）是否受到影響；最后，我們將探索沉默Idl基因?qū)CT116細(xì)胞體外上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）特性、侵襲轉(zhuǎn)移和體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移是否產(chǎn)生影響，并初步分析Id1介導(dǎo)侵襲轉(zhuǎn)移的可能分子機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1.采用Real-time熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)30例CRC病例新鮮組織中癌組織與正常大腸組織的I

5、d1與CD133 mRNA表達(dá)情況;采用免疫組織化學(xué)染色方法（Immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)75例CRC患者癌組織、20個(gè)正常大腸組織的中Id1與CD133蛋白表達(dá)情況，并分析它們與臨床病理特征的關(guān)系。采用spearman相關(guān)分析Id1與CD133 mRNA和蛋白表達(dá)的相關(guān)性。
　　2.采用shId1和shcontrol(對(duì)照組)慢病毒感染HCT116細(xì)胞,構(gòu)建Id1基因穩(wěn)定沉默的細(xì)胞株模型。利用qRT-P

6、CR和Western Blot檢測(cè)Id1mRNA和蛋白表達(dá)，驗(yàn)證Id1沉默效應(yīng)；MTS法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；AnnexinV-PE/7-AAD檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；qRT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)分子PCNA、Survivin的表達(dá)情況；利用體外無血清懸浮球培養(yǎng)方法檢測(cè)體外細(xì)胞自我更新功能；qRT-PCR、Western blot、FACS檢測(cè)CRC干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)TCF/

7、LEF啟動(dòng)子活性；構(gòu)建BABL/C裸鼠皮下移植瘤模型，不同濃度梯度細(xì)胞接種后檢測(cè)啟動(dòng)腫瘤能力。
　　3.倒置顯微鏡觀察穩(wěn)定沉默Id1后HCT116細(xì)胞形態(tài)變化；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室模型檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力；qRT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞侵襲、EMT相關(guān)分子（MMPs、TIMPs、CXCR4、snail、twist和 E-cadherin）的表達(dá)情況；構(gòu)建BABL/C裸鼠脾臟移植瘤肝轉(zhuǎn)移模型，分析Id

8、1基因下調(diào)對(duì)肝轉(zhuǎn)移影響。
　　結(jié)果：
　　1.Id1mRNA在結(jié)CRC中的表達(dá)量明顯高于正常腸粘膜組織(0.391±0.095 vs.0.21±0.039,p<0.05),CD133 mRNA在CRC中的表達(dá)量也比正常腸粘膜組織高（0.207±0.036 vs.0.105±0.028, p<0.05）），兩者mRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（R=0.401，P=0.031）。IHC結(jié)果顯示Id1在35例（46.7%）CRC癌組織具有

9、高表達(dá)，表達(dá)與分化程度呈負(fù)相關(guān)，而20例正常大腸上皮中標(biāo)本均表現(xiàn)為陰性表達(dá)。22例(29.3%)結(jié)直腸腸癌組織呈現(xiàn)CD133高表達(dá)，CD133表達(dá)與T分期呈正相關(guān)，正常腸粘膜中僅2例高表達(dá)，其余表現(xiàn)為陰性表達(dá)。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Id1蛋白的表達(dá)與CD133具有正相關(guān)性關(guān)系（R=0.319，P=0.005）。
　　2.（1）HCT116細(xì)胞Id1基因沉默后，與對(duì)照組比較其細(xì)胞增殖活性明顯下降、凋亡增加，PCNA和surv

10、ivin的mRNA和蛋白水平也明顯下調(diào)。HCT116細(xì)胞Id1基因沉默后，與對(duì)照組比較其細(xì)胞球大小和數(shù)量明顯下降；干細(xì)胞標(biāo)志物CD24、CD133、EZH2、EpCAM、OCT4和β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降，但是CD44、CD166和Lgr5蛋白表達(dá)未見明顯變化；Id1沉默的細(xì)胞株加入5-Fu后IC50是5.2±0.3μM，對(duì)照組細(xì)胞加入5-Fu的IC50是8.4±0.4μM，兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05

11、）；細(xì)胞核和胞漿中β-catenin在Id1沉默細(xì)胞株的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，TCF/LEF啟動(dòng)子活性在Id1沉默細(xì)胞株明顯低于對(duì)照組細(xì)胞株。Wnt/β-catenin通路常見的下游分子CyclinD1和survivin的mRNA和蛋白水平也明顯下降。
　?。?）裸鼠皮下移植瘤試驗(yàn)證明Id1沉默的HCT116細(xì)胞形成的皮下移植瘤體積較對(duì)照組小（P<0.05）；對(duì)照組1×105就可以啟動(dòng)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，但是對(duì)于Id1基因沉默組要5×

12、105細(xì)胞數(shù)才能啟動(dòng)腫瘤的生長(zhǎng)，Id1沉默后HCT116細(xì)胞在體內(nèi)啟動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)的能力較對(duì)照組下降了約5倍。
　　3.（1）Id1沉默的HCT116細(xì)胞表現(xiàn)為上皮樣形態(tài)，排列規(guī)則、細(xì)胞與細(xì)胞緊密連接、成團(tuán)生長(zhǎng)，EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)增高，而snail和twist則表達(dá)明顯降低；HCT116細(xì)胞Id1基因沉默后，與對(duì)照組比較其遷移能力下降、穿過transwell小室的細(xì)胞數(shù)也明顯下降；MMP2、MMP9、CXCR4 m

13、RNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，而TIMP1、TIMP2蛋白表達(dá)升高；HCT116細(xì)胞Id1穩(wěn)定沉默后轉(zhuǎn)染外源性CXCR4可以部分逆轉(zhuǎn)因Id1下調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞遷移和侵襲能力的下降。
　?。?）Id1下調(diào)的HCT116細(xì)胞接種到裸鼠脾臟后肝臟轉(zhuǎn)移率為60%（6/10），而對(duì)照組100%形成肝臟轉(zhuǎn)移灶（10/10）,肝臟重量在 Id1下調(diào)組明顯輕于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　在CRC中，Id1的表達(dá)