MiR-375對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的生物學(xué)功能的影響.pdf

1、目的：
　　脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-375 mimics轉(zhuǎn)入HCT116細(xì)胞上調(diào)miR-375的表達(dá)，用實(shí)時(shí)定量-PCR法檢測(cè)miR-375和AEG-1 mRNA的表達(dá)情況;MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的改變情況;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)miR-375對(duì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響;我們通過(guò)研究miR-375對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116生物學(xué)行為的影響，旨在為結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1.材料:人結(jié)直腸癌細(xì)胞株

2、Caco2、HCT116、SW480、SW620均購(gòu)自CTCC（中國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)Chinese Type Culture Collection，中國(guó)北京）;DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;0.25％胰蛋白酶購(gòu)自杭州吉諾生物有限公司;miR-375 mimics和negative control轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司;Lipofectmanine TM2000及TRIzol試

3、劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自廣州威佳公司;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Fermentas公司;SYBRPremix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)為TaKaRa公司產(chǎn)品。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng):Caco2、HCT116用含10％

4、胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，SW480、SW620用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每1～2d換液培養(yǎng)1次，當(dāng)細(xì)胞覆蓋瓶底壁大部分表面時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代或收集細(xì)胞。
　　3.實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)不同結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-375的表達(dá)情況:收集細(xì)胞，按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)抽提結(jié)直腸癌細(xì)胞株Caco2、HCT116、SW620和SW4

5、80中的總RNA，-80℃凍存?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-375的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參，引物均購(gòu)自廣州銳博公司。結(jié)果采用2-△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，△Ct=目的基因平均Ct值-內(nèi)參基因平均Ct值。
　　4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前1d，將適量（約4×104～5×104）生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定的HCT116細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入不含抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)液400μL。密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30

6、％～50％時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組(miR-375 mimics)和對(duì)照組（negative control，NC）的轉(zhuǎn)染。用50μL不含血清的培養(yǎng)基Opti-MEM對(duì)5μL濃度為20μmol/L的miR-375 mimics和negativecontrol進(jìn)行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 min。用50 tL的不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM對(duì)1.5μL Lipofectmanine TM2000進(jìn)行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 mi

7、n。將稀釋好的miR-375 mimics和negative control與LipofectmanineTM2000混合，輕柔混勻，室溫下溫育20 min，以形成混合物。100μL混合物加到培養(yǎng)板的孔中，輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板使其與培養(yǎng)液混勻。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5％的培養(yǎng)箱中，在37℃下培養(yǎng)6h后，移除每孔中含有混合物的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液。繼續(xù)在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5％的條件下培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其他實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

8、。
　　5.實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-375和AEG-1 mRNA的表達(dá)情況:轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，按照TRIzol說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞中的總RNA，-80℃凍存?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)熒光定量-PCR檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-375的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參照，引物購(gòu)自廣州銳博公司。實(shí)時(shí)熒光定量-PCR檢測(cè)細(xì)胞中AEG-1mRNA的表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參，引物購(gòu)自TaKaRa公司。結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)

9、量，△Ct=目的基因平均Ct值-內(nèi)參基因平均Ct值。
　　6.MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況:將轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞約3000個(gè)（每孔加培養(yǎng)液100μL），置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5％的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)4h、24 h、48 h和72 h后加入MTT工作液，每孔加入0.5％ MTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，輕輕吸出孔內(nèi)液體，然后在每孔中加入二甲基亞砜150μL，應(yīng)用全自動(dòng)酶

10、標(biāo)儀，檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm下的吸光度(OD)值。以時(shí)間作為橫坐標(biāo)，計(jì)算所得OD值的均數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期:轉(zhuǎn)染48 h后消化收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，然后1200 r/min離心5 min，棄上清。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，PI細(xì)胞染色，即加入1000μL staining buffer(A)及10μL reagent B染色，混勻后室溫避光孵育30 min，立即上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

11、>　　8.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:轉(zhuǎn)染48 h后消化收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，然后1200 r/min離心5 min，棄上清。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，用500μL1×binding buffer重懸細(xì)胞，加入5μL FITC標(biāo)記的annexin-Ⅴ，加入10μL的PI?；靹蚝笫覝乇芄夥跤? min，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　9.應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)

12、準(zhǔn)差(mean±SD)表示，符合正態(tài)分布且方差齊者采用t檢驗(yàn)或者ANOVA檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett T3校正，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.miR-375在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況:提取結(jié)直腸癌細(xì)胞株(Caco2、HCT116、SW620、SW480)中的總RNA，以U6作為內(nèi)參，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量-PCR法檢測(cè)miR-375的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果采用2-△Ct法計(jì)算miR-375的相對(duì)表達(dá)量。其中以HC

13、T116細(xì)胞中miR-375的表達(dá)水平最低，因此選取HCT116細(xì)胞株作為我們進(jìn)一步研究的對(duì)象。
　　2.miR-375 mimics對(duì)HCT116細(xì)胞中miR-375和AEG-1 mRNA表達(dá)的影響:miR-375 mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞48 h后，采用實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組HCT116細(xì)胞中miR-375和AEG-1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-375 mimic后miR-37

14、5的表達(dá)水平明顯上調(diào)，其表達(dá)水平約是陰性對(duì)照組的2000倍(P＜0.01)，同時(shí)miR-375的高表達(dá)導(dǎo)致AEG-1mRNA表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。以上結(jié)果提示，miR-375 mimics可上調(diào)miR-375的表達(dá)，同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-375可抑制AEG-1 mRNA的表達(dá)。
　　3.miR-375過(guò)表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)的影響:MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-375 mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時(shí)的OD

15、值均低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。miR-375過(guò)表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞的活力具有明顯抑制作用。
　　4.miR-375過(guò)表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響:流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后各組細(xì)胞的周期分布，結(jié)果顯示，miR-375 mimics組與陰性對(duì)照組在G1期、S期和G2期細(xì)胞所占比例分別為（68.323±2.975）％vs（54.973±3.056）％、(16.443±0.422)％vs(27.767±3.

16、636)％、（14.200±0.943)％vs(17.26±2.268)％,2組間經(jīng)比較，miR-375 mimics組G1期細(xì)胞所占比例明顯增多(P＜0.01)，S期細(xì)胞所占比例明顯減少(P＜0.05)。
　　5.miR-375過(guò)表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡率的影響:流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后各組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示，miR-375mimics組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別為（8.468±1.546）％和（6.252±1.201

17、）％，陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率明顯低于miR-375 mimics組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.miR-375mimics組中miR-375表達(dá)量較對(duì)照組明顯上調(diào);miR-375抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的細(xì)胞活性，介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)其凋亡。
　　2.miR-375高表達(dá)可以顯著抑制AEG-1 mRNA的表達(dá)水平，miR-375作為一種抑癌因子，在結(jié)腸癌中可能通過(guò)抑制癌基因AEG-1的表